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Projekt
Proteomische Untersuchungen von Replikations-Stress bedingten, mitotischen Schwestern-Chromatid-Vernetzungen
Antragsteller
Dr. Markus Räschle
Fachliche Zuordnung
Zellbiologie
Förderung
Förderung seit 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 395736209
Replikationsstress ist eine Hauptursache für genomische Instabilität und wurde in engem Zusammenhang mit Krebs und anderen humanen Erkrankungen gesetzt. Milder Replikationsstress, der für pathologische Situationen besonders relevant ist, erlaubt es Zellen, trotz eines unvollständig replizierten Genoms in die Mitose einzutreten. An der unvollständig replizierten DNA bilden sich sogenannte ultrafeine Brücken („ultra-fine bridges“, UFBs), welche die Schwesterchromatide verbinden und die Chromosomensegregation beeinträchtigen. Verschiedene Proteine lagern sich an den UFBs an, um sie aktiv aufzulösen. Eines dieser Proteine ist die BLM-Helikase, deren Inaktivierung das Bloom-Syndrom verursacht. Da BLM nicht nur an UFBs rekrutiert wird, sondern auch eine zentrale Rolle in der Resektion von DNA-Enden, der Auflösung von DNA-Rekombinationsintermediaten oder der Reaktivierung von blockierten Replikationsgabeln spielt, war es bislang schwierig festzulegen, in welchem Umfang die Auflösung von UFBs zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität beiträgt. Wir haben diese Frage adressiert und haben chromosomal stabile HCT116-Zellen erzeugt, in denen das BLM-Protein schnell und induzierbar abgebaut werden kann. In unserem geplanten Projekt werden wir diese Zellen nutzen, um zu untersuchen, wie sich der gezielte Abbau von BLM in verschiedenen Phasen des Zellzyklus auf die Genomstabilität auswirkt. Mit Hilfe von Mikroskopie lebender und fixierter Zellen werden wir die Progression von synchronisierten Zellen durch die S-Phase verfolgen und deren Schicksal in An- und Abwesenheit von BLM analysieren. Wir erwarten, dass Defekte in der Auflösung von UFBs die Chromosomensegregation nachhaltig beeinträchtigen. Um dies zu testen, werden wir die Progression der Mitose und karyotypischen Veränderungen mittels „next generation“ Sequenzierung direkt nach der ersten Mitose bestimmen. Um die Mechanismen zu definieren, die der Auflösung von UFBs zugrunde liegen, werden wir unsere bereits etablierte Methodik der Chromatin-Immunpräzipitations-Massenspektrometrie verwenden und neue Faktoren identifizieren, die mit BLM oder anderen bekannten UFB-assoziierten Proteinen Komplexe an mitotischen Chromosomen bilden. Durch diese umfassende Charakterisierung sollen neue Erkenntnisse zu den zellulären Prozessen gewonnen werden, welche die Folgen von Replikationsstress mildern und zu einer zuverlässigen Chromosomentrennung beitragen.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
