Die mechanistischen Grundlagen der Biogenese der äußeren Membran erforscht unter in-situ Bedingungen mit EPR Spektroskopie

• Antragsteller: Benesh Joseph, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 411411450

Die äußere Membran (OM) gram-negativer Bakterien ist eine asymmetrische Lipiddoppelschicht, bestehend aus Phospholipiden und Lipopolysacchariden (LPS). Sie enthält eine Vielzahl an β-Barrel Proteinen (OMPs genannt), die an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind. Die Biogenese der OM besteht aus dem Transport von unzähligen LPS Molekülen durch die Zellkompartimente und außerdem dem Falten und Einbau zahlreicher OMPs während jedes einzelnen Zellzyklus. In E. coli bilden sieben Proteine (LptA-G) das LPS Transport (Lpt) System, die Energie für den Transport stellt der ABC Exporter LptB2FG bereit. Ähnlich dazu läuft das Falten und der Einbau von den OMPs ab, die BamA-E Untereinheiten bilden den dafür benötigten BAM-Proteinkomplex. Sowohl der BAM-Proteinkomplex als auch das Lpt System sind essentiell wichtige Einheiten, die in allen gram-negativen Bakterien vorhanden sind. Deswegen sind sie potentielle Targets in der Entwicklung von neuartigen antibakteriellen Medikamenten. Das übergeordnete Ziel dieses Projektes ist es, die Mechanismusgrundlagen der beiden Systeme BAM und Lpt für die OM Biogenese zu verstehen. Für die hochauflösende strukturelle Biologie sind diese Systeme eine große Herausforderung, da BAM und Lpt große und dynamische Heterooligomere mit komplexen Substraten sind. Beide Proteinkomplexe durchlaufen eine komplexe Energielandschaft um die für ihre Funktion notwendigen Konformationsänderungen zu erreichen. Daher ist das Verstehen der Konformationsänderungen und der Gleichgewichtsdynamik unabdingbar um die Funktionsmechanismen zu beschreiben. Darüber hinaus ist die OM selbst ein Bestandteil dieser molekularen Maschinerien da die Substrate direkt in die OM eingebaut werden. Daher werden Experimente unter in-situ Bedingungen (ganze E. coli oder natürliche OM) für ein ganzheitliches Verständnis benötigt. Wir wollen die konformelle Heterogenität und die Dynamiken, die die Grundlage der Funktion der Proteinkomplexe BAM und LptB2FGC bilden, sowohl unter in-vitro als auch unter in-situ Bedingungen untersuchen. Zu diesem Zweck werden wir hochmoderne EPR Spektroskopie Techniken mit biochemischen und biophysikalischen Methoden kombinieren. Für BAM wird sowohl die Konformationsdynamik der Transmembrandomäne β-Barrel BamA als auch der Einfluss der Lipoproteine BamB-E und des Substrats in E. coli, natürlichen OM und Detergenzien untersucht um die Grundlagen der Faltungs- und Einbaumechanismen von OMP zu verstehen. Für das Lpt System wird der Mechanismus des Energietransfers in dem außergewöhnlichen ABC Exporters LptB2FG (der Energie für das ganze System bereit stellt, PDB 5X5Y) in Detergenzien und natürlicher Lipidmembran untersucht. Die Struktur des LptB2FGC Komplexes wird mit PELDOR/DEER Abständen modelliert und sein Transport von LPS Molekülen wird in natürlichen Lipid Doppelschichten untersucht. Außerdem wird die in-situ EPR, die wir schon für die OMPs demonstriert haben, für Spinlabeling und PELDOR im Periplasma weiterentwickelt.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen