Aufdeckung des biosynthetischen Potentials von Pilzen durch heterologe Expression stummer Gencluster in Aspergillus nidulans und LC-MS-basierte Metabolomanalyse

• Antragsteller: Professor Dr. Shu-Ming Li
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 410588509

Naturstoffe (NP), insb. Sekundärmetabolite (SM), spielen eine wichtige Rolle bei der Wirkstofffindung und Entwicklung. Mikroorganismen wie Actinobacteria und Ascomykota sind wichtige NP-Produzenten. Pilze gewinnen für die NP-Produktion in der Pharma-Forschung immer mehr an Bedeutung. Die Gene für die SM-Biosynthese sind in der Regel im Genom als biosynthetische Gencluster (BGC) organisiert. Diese haben Gene für Grundgerüstsynthese, Modifikationen und eventuell zusätzlich für Regulation und Transport. Die Analyse sequenzierter mikrobieller Genome offenbart das größtenteils ungenutzte biosynthetische Potential. Die meisten der SM-BGCs sind gar nicht oder nur schwach exprimiert, was die Entdeckung neuer NPs erschwert. Dies wurde auch für die Stämme im Projekt beobachtet. Ziel dieses Projektes ist der Aufbau einer neuen Plattform, welche die Stärke der Genomik und der synthetischen Biologie mit einer integrierten Metabolic Profiling Toolbox vereinen soll, um stumme Gene für SM zu aktivieren und deren Biosynthesewege aufzuklären. Zunächst sollen 11 SM BGCs aus Penicillium crustosum und 9 aus Pestalotiopsis fici in einem speziellen A. nidulans-Stamm exprimiert werden. Die Strukturgene werden mit Hilfe von SOE-PCR über homologe Rekombination in Hefe in einen E. coli-Saccharomyces-Aspergillus Shuttle-Vektor kloniert. Zur Aktivierung der Gene wird der Promoter des Transkriptionsfaktors im BGC durch einen künstlichen ersetzt.Für die heterologe Expression wird A. nidulans mit Deletionen von nkuA und Genen der 8 SM Biosynthesewege verwendet. Dadurch werden nicht-homologe Rekombinationsereignisse minimiert und der SM-Hintergrund des Stammes reduziert. Der wA-Lokus kodiert für ein nicht-essentielles PKS-Pigment. Da dies ein einfaches Screening auf korrekte Integration erlaubt, stellt er eine ideale Integrationsstelle für die BGCs dar.Die Analyse der SMs durch LC-HRMS ermöglicht die Detektion kleiner SM-Änderungen und liefert so Beweis über eine erfolgreiche BGC-Aktivierung. Ein zusätzlicher Vergleich mit öffentlichen und hauseigenen NP-Datenbanken ermöglicht das Erkennen struktureller Neuheiten. Strukturen neuer SMs werden spektroskopisch aufgeklärt. Bei Bedarf werden Isotopen-markierte Vorstufen und Röntgenanalyse für neue Substanzen eingesetzt. Die Wichtigkeit und Funktion der entsprechenden Gene in Clustern werden anschließend durch Gendeletion, Expression der modifizierten Konstrukte und anschließend Detektion von Intermediaten nachgewiesen.Beide Antragsteller arbeiten an der Biosynthese pilzlicher SMs und weisen sich ergänzende Kompetenzen auf. Die in diesem Projekt verwendeten genetischen Methoden wurden von Yin etabliert und die Gruppe von Li hat langjährige Erfahrung in der Analyse und Strukturaufklärung pilzlicher SMs. Es existiert eine fruchtbare Kooperation zwischen den Arbeitsgruppen, was eine erfolgreiche Realisierung des Projektes gewährleistet. Heterologe Expression stummer BGCs wird den Weg, vom Genom zu NPs und zu Wirkstoffen, stark kürzen

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: China
• Partnerorganisation: National Natural Science Foundation of China
• Kooperationspartner: Professor Dr. Wenbing Yin