Funktion und Evolution von archaeellen stand-alone Cas- und Cas-verwandten Anti-CRISPR-Genen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Ruth Anne Schmitz-Streit
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405891535

Die Endonuklease Cas1 ist eines der beiden wesentlichen Proteine von CRISPR/Cas-Systemen. Eine eindeutig distinkte phylogenetische Gruppe von Cas1-Proteinen liegt kodiert auf neu identifizierten mobilen Elementen vor, den sogenannten Casposons. Diese repräsentieren vermutlich die erste Familie von selbst-synthetisierenden Transposons in Prokaryoten. Bezüglich der Insertionsstellen weisen Casposons deutliche Präferenzen auf und ähneln stark den eukaryotischen DNA-Transposons der Polinton/Maverick-Superfamilie. Mittels einer komparativen Genomanalyse von 62 verschiedenen Methanosarcina mazei-Stämmen wurde der Nachweis für eine erst kürzlich erfolgte Mobilität innerhalb des Genoms erbracht. Das im Genom des Methanosarcina mazei Stamms Gö1 identifizierte Casposon gehört zu der Familie-2-Casposons, die eine vorhergesagte Casposase beinhalten (Casposon-kodiertes Cas1). Das vorliegende Projekt zielt darauf ab (i) den Transpositionsmechanismus des neu identifizierten Casposons in M. mazei Gö1 aufzuklären. Hierzu soll das Casposon mit verschiedenen Ansätzen charakterisiert werden, wobei insbesondere die Charakterisierung der Casposase und ihre Fähigkeit, die kürzlich identifizierten Zielstellen innerhalb des M. mazei Genoms zu erkennen und zu binden, im Fokus stehen. Hierbei sollen Einblicke mittels in vitro Integrase-Assays, mittels der MikroThermophorese-Technik und durch Etablierung und Anwendung eines MiniCasposons gewonnen werden. (ii) Die Casposon-Mobilität wird in einem Langzeit-Evolutionsexperiment untersucht und verfolgt. Hierbei werden sowohl der Wildtyp-Stamm als auch ein Stamm, der die Casposase überexprimiert, analysiert; wobei beide Stämme verschiedenen Stressfaktoren unterworfen werden. Zusätzlich werden Analysen mit einem modifizierten Casposon durchgeführt, das einen selektierbaren Marker beinhaltet. (iii) Mehrere neue Methanosarcina-Stämme werden isoliert und auf Casposons analysiert. (iv) Es werden bioinformatische Analysen durchgeführt von bereits verfügbaren und im Projekt isolierten und sequenzierten Methanosarcina-Species, von bereits vorliegenden Metagenom- und assoziierten Metatranskriptom-Datensätzen eines Biogasreaktors, sowie von den Populationssequenzierungen von M. mazei mit mobilisierten Casposons im Evolutionsexperiment. Diese biofinformatorischen Analysen werden einen umfassenden Einblick in die Entwicklung von Casposons in Methanosarcina erzielen. Insbesondere werden wir Einsichten in die Evolution der verschiedenen Casposons, in die Casposon-Insertionsstellen im Genom und in die induzierten genomischen Umorganisationen erhalten. Insgesamt wird die Kombination dieser experimentellen und bioinformatischen Analysen neue Einblicke in Casposons und deren Evolution ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2141: Weitaus mehr als nur Verteidigung: die vielen verschiedenen Funktionen des CRISPR-Cas Systems
• Internationaler Bezug: Niederlande
• Kooperationspartnerin: Professorin Dr. Anne Kupczok, Ph.D.