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Projekt
CRISPR-Cas Funktionen in der Stress-Antwort von Rhodobacter capsulatus
Antragstellerin
Professorin Dr. Gabriele Klug
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung von 2018 bis 2023
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405838474
Das Genom des fakultativ phototrophen Alphaprotobakteriums Rhodobacter capsulatus enthält mehrere CRISPR-Cas Systeme verschiedener Typen, während der Verwandte R. sphaeroides keinerlei CRISPR-Cas Komponenten aufweist. RNAseq Analysen zeigten, dass die Level einiger CRISPR RNAs in Anwesenheit von Singulett-Sauerstoff erhöht sind. Dieses Ergebnis wurde durch Northern Blots bestätigt, die auch nachwiesen, dass weitere Stressbedingungen die Mengen der CRISPR RNAs des Klasse 2, Typ VI Systems beeinflussen. Überexpression des Cas13a Proteins dieses Systems bewirkte in R. sphaeroides eine verminderte Resistenz gegen Ampicillin und Wasserstoffperoxid, aber eine leicht erhöhte Resistenz gegen Wasserstoffperoxid in R. capsulatus. Ziel dieses Projektes ist es, die Signalwege aufzuklären, die zur stressabhängigen Expression der CRISPR-Cas Komponenten in R. capsulatus führen, sowie die molekularen Mechanismen, die dem Effekt der CRISPR-Cas Komponenten auf die Stressresistenz in beiden Stämmen zugrunde liegen. Wir werden den Effekt einer größeren Vielfalt an Stressbedingen auf die Expression der CRISPR-Cas Komponenten testen und werden Stämme, die ausgewählte CRISPR-Cas Komponenten überexprimieren oder deletiert haben unter verschiedenen Wachstumsbedingungen untersuchen. Diese Analysen werden auch in Mutanten erfolgen, denen bestimmte regulatorischen Faktoren oder bekannte RNasen fehlen, um deren Beitrag zu den beobachteten Effekten zu testen. Ein bioinformatischer Ansatz soll RNAs im Genom von R. capsulatus identifizieren, die mögliche targets der CRISPR RNAs sein könnten. Sollten solche RNAs identifiziert werden, werden wir die RNA-RNA Interaktion und RNA Prozessierung in vitro untersuchen und den RNA Abbau in vivo verfolgen. Für CRISPR-Cas Komponenten, die einen deutlichen phänotypischen Effekt bei Deletion oder Überexpression zeigen, werden wir globale Transkriptomstudien (RNAseq) und Proteomstudien mit den Mutanten durchführen, um alle RNAs und Proteine zu identifizieren, deren Level beeinträchtigt wird. Zu Beginn werden wir uns v.a. auf das Klasse 2 System und das Cas13a Protein konzentrieren, das auch in anderen Projekten des Schwerpunktes untersucht wird und für das wir eindeutige Effekte in unseren Vorarbeiten beobachtet haben. Später sollen auch weitere CRISPR-Cas Komponenten einbezogen werden. Detaillierte Strategien für die Untersuchungen der CRISPR-Cas abhängigen Signalwege können erst auf der Basis der Zwischenergebnisse entwickelt werden. Diese Projekt soll das Verständnis der CRISPR-Cas Funktionen erweitern, die nicht die Phagenabwehr betreffen, und soll die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und Signalwege aufklären.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
