Engineering von O2-toleranten Hydrogenasen und ihre physiologischen Auswirkungen in rekombinanten Bakterien im Hinblick auf die Hydrogenase-abhängige NAD(P)H-Regeneration und H2-Produktion

• Antragsteller: Professor Dr. Bruno Bühler; Professor Dr. Lars Lauterbach
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405325648

Die Anwendung von Hydrogenasen für H2-getriebene Biotransformationen bzw. H2 Produktion in lebenden Mikroorganismen stellt eine große Herausforderung dar, weist aber ein enormes Potential für biotechnologische Anwendungen hin zu einer nachhaltigen Bioökonomie auf. Sowohl strukturell, als auch mechanistisch sind Hydrogenasen hoch komplexe Enzyme, welche, wenn heterolog in lebenden Zellen synthetisiert, eine metabolische Last darstellen können. Dieses Forschungsprojekt fokussiert auf O2-tolerante Hydrogenasen mit hohem Anwendungspotential für biokatalytische Oxyfunktionali-sierungen und Photosynthese-getriebene H2 Produktion. Dafür zielen wir auf deren Verbesserung auf molekularer Ebene und die Aufklärung von deren Zusammenspiel mit der Zellphysiologie ab, wofür quantitative Physiologie-Studien und metabolische Flußanalysen geplant sind. Ein vorhandener Pseudomonas putida Stamm, der eine P450 Monooxygenase zusammen mit der O2-toleranten NAD+-reduzierenden Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha H16 enthält, dient dabei als Startpunkt. Zudem wird die SH zur NADH Regeneration in hochaktive Styrol epoxidierende Escherichia coli and Pseudomonas Stämme eingebracht. Für NADPH-abhängige Baeyer-Villiger Oxidation basierend auf hochaktiven rekombinanten Pseudomonas und E. coli Stämmen wird mittels Protein-Engineering NADP(H)-Akzeptanz durch die SH angestrebt. Mit dem Ziel der H2-Bildung in vivo werden zudem SH-Varianten mit einer Präferenz für H+-Reduktion erzeugt. Als Selektions-/Screeningtool und zur Charakterisierung der H2-Bildungskapazität werden geeignete E. coli-Mutanten und Pseudomonaden unter mikro- und anaeroben Bedingungen eingesetzt. Diese Hydrogenasevarianten werden dann bezüglich des Einflusses der H2-Produktion wie auch der H2-Oxidation auf den Metabolismus rekombinanter Hydrogenase-enthaltender Bakterien charakterisiert. Dieses Forschungsprojekt wird die Verwendung von H2 als billigem und „grünem“ Reduktionsmittel in biotechnologischen Ganzzell-Prozessen vorantreiben und einen wichtigen Schritt hin zur nachhaltigen Produktion von H2 als Biokraftstoff ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen