Ein Multiplexing-CRISPRa-Ansatz für die genunabhängige Therapie der Netzhautdegeneration

• Antragsteller: Professor Dr. Martin Biel, seit 6/2022
• Fachliche Zuordnung: Augenheilkunde ; Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 399299380

Erbliche Netzhautdystrophien (ENDs) umfassen eine breite Gruppe verschiedener Erblindungserkrankungen, die zum progressiven Verlust der Netzhaut führen. Die meisten Therapieansätze fokussieren sich derzeit auf einzelne Gene oder Mutationen. Eine deutlich attraktivere Alternative ist die Entwicklung von Strategien, die den Krankheitsverlauf unabhängig vom zu Grunde liegenden Gen oder Krankheitsmechanismus stoppen können. Eine vielsprechende Möglichkeit dazu stellt die Expression neuroprotektiver oder der Knockdown potenziell schädlicher Gene dar. In der Vergangenheit wurden verschiedene neuroprotektive oder zellschädigende Gene bzw. Proteine identifiziert und für einige davon wurde die Wirkung ihrer Supplementierung bzw. ihres Knockdowns an Mausmodellen evaluiert. Trotz einiger Fortschritte bleibt jedoch unklar, ob eine Kombination aus verschiedenen zellprotektiven Proteinen und ihren Rezeptoren bzw. der gleichzeitige Knockdown potenziell schädigender Gene zusätzliche positive Effekte auf die Effizienz und Dauer des Therapieerfolgs haben. Um die Testung solcher kombinatorischen Ansätze in vivo zu ermöglichen, soll in diesem Antrag die modulare CRISPR-Cas-Technologie angewendet werden, die sich zur Aktivierung einzelner oder mehrerer Gene (CRISPRa) mit Hilfe Locus-spezifischer single guide RNAs (sgRNAs) eignet. In unseren Vorarbeiten haben wir CRISPRa bereits zur Gentherapie eines END-Mausmodells erfolgreich angewendet. In weiteren Vorarbeiten haben wir gezeigt, dass sich CRISPRa auch zum gleichzeitigem Knockdown anderer Gene in vivo eignet. In den beantragten Versuchen sollen zunächst verschiedene sgRNAs in vitro optimiert werden, die sich zur Aktivierung von Genen, die für neuroprotektive Proteine und deren Rezeptoren kodieren, eignen (Transaktivierungs-Multiplexing-Einheit, TAMU). In weiteren Versuchen werden wir die Effizienz verschiedener TAMU-Kombinationen auf RNA und Proteinebene in vitro und in vivo testen. Für die in vivo Anwendung sollen die TAMUs und CRISPRa mittels dualer rekombinanter Adeno-assoziierter viraler (rAAV) Vektoren exprimiert werden. Anschließend soll die Effizienz optimierter TAMUs am Pde6bH620Q/Cre Mausmodell für Retinitis Pigmentosa analysiert werden. Pde6bH620Q/Cre Mäuse bieten den Vorteil, dass der Degenerationsverlauf durch Tamoxifen-Injektion zu jedem beliebigen Zeitpunkt gestoppt und so der maximal zu erreichende therapeutische Effekt gemessen werden kann. Der Therapieerfolg einzelner TAMUs wird zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion auf molekularer, morphologischer, funktioneller und verhaltensbiologischer Ebene überprüft und mit Tamoxifen injizierten Mäusen verglichen werden. Das effizienteste TAMU wird schließlich mit Knockdown-sgRNAs kombiniert und am Pde6bH620Q/Cre Mausmodell evaluiert werden. Im Falle des Erfolgs wird dieser Ansatz eine Machbarkeitsstudie für eine genunabhängige kombinatorische Gentherapie liefern, von dem weltweit Millionen Patienten profitieren könnten.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2127: Gen- und Zellbasierte Therapien für die Behandlung neuroretinaler Degeneration
• Ehemaliger Antragsteller: Dr. Elvir Becirovic, bis 5/2022