CRISPR/Cas Systeme von Cyanobakterien im Kontext von Zelldifferenzierung und metabolischer Manipulation

• Antragsteller: Professor Dr. Wolfgang R. Hess
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 391592464

CRISPR Interferenz (CRISPRi) ist gegenwärtig die am meisten verwendete Technologie zur Manipulation der Genexpression und zum Genome Editing. Hierbei wird meistens das CRISPR-Cas Typ II Enzym Cas9 zusammen mit einer guide RNA verwendet, um so spezifische Regionen in der chromosomalen DNA zu erreichen. Diese Klasse 2 CRISPR-Cas Systeme sind evolutionär vermutlich aus einer diversen Gruppe mobiler genetischer Elemente entstanden, die in Cyanobakterien besonders abundant sind. Bioinformatische Analysen zeigen, dass bestimmte filamentöse Cyanobakterien besonders reich an solchen Systemen sind, mit z. B. 11 möglichen CRISPR-Cas Systemen in dem Modellorganismus Anabaena sp. PCC7120. Diese Arten differenzieren in einem komplexen genetischen Prozess Heterozysten, auf die Fixierung von Luftstickstoff spezialisierte Zellen. In dem hier vorgeschlagenen Projekt möchten wir die CRISPR-Cas Systeme in Anabaena sp. PCC7120 detailliert untersuchen und eine mögliche Verbindung zur Heterozystendifferenzierung aufklären. Wir möchten das Subtyp III-D System untersuchen, welches ein ungewöhnliches Fusionsprotein aus Cas1 und einer Reversen Transkriptase und eine zweigeteilte repeat-spacer Kassette verwendet und in dem genetischen Element lokalisiert ist, welches das the fdxN Gen unterbricht und während der Zelldifferenzierung ausgeschnitten wird. Wir werden das Klasse 2 c2c5 CRISPR-Cas System biochemisch und molekulargenetisch untersuchen, welches vermutlich das Alr3613 Protein als Effektorprotein verwendet. Es ist gegenwärtig nicht verstanden, wie solch erst kürzlich vorhergesagten Klasse 2 Systeme systems ohne cas1 Gene ihre repeat-spacer Arrays anpassen können. Wir möchten diese Frage mittels Interferenzassays und Mutantenanalysen untersuchen, unter der Hypothese, dass entweder Cas1 Aktivität von einem der drei kassischen Systeme in Anabaena sp. PCC7120 in trans bereit gestellt wird, oder dass möglicherweise Rekombinasen der Heterozystendifferenzierung an diesem Prozess beteiligt sind. Unsere Analysen werden durch globale Assays ergänzt werden, die auf die Funktionalität aller 11 vorhergesagten Systeme abzielen. Das Projekt wird zur Charakterisierung neuartiger CRISPR-Cas Effektorproteine führen, welche die existierenden, auf Cas9, C2c1 und Cpf1 beruhenden Werkzeuge ergänzen, die Konstruktion effizienterer und genetisch stabiler cyanobakterieller Produzentenstämme für die biotechnologische Herstellung von Biokraftstoffen und anderen nützlichen Metaboliten ermöglichen und substantielle neue Einsichten in die Funktionen verschiedenartiger CRISPR-Cas Systeme und die Differenzierung bakterieller Zellen ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: China
• Partnerorganisation: National Natural Science Foundation of China
• Kooperationspartner: Professor Dr. Xuefeng Lu