Verständnis und Vermehrung der Pilz-Bisorbicillinoid-Biosynthese

• Antragsteller: Professor Dr. Russell J. Cox
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 388965482

Die Sorbicillinoide sind eine privilegierte Familie von Pilzmetaboliten mit einer breiten Palette von Strukturen und biologischen Aktivitäten. In früheren Arbeiten konnten wir den Biosyntheseweg zum Schlüsselvorläufer Sorbicillinol etablieren. Allerdings sind die späteren Prozessierungsschritte, die für die biologische Vielfalt entscheidend sind, noch nicht aufgeklärt. Der Pilz T. reesei ist ein effektiver Produzent von Sorbicillinoiden und das Genom ist öffentlich verfügbar. Wir haben ein Gencluster (GC) für die Sorbicillinoid-Biosynthese identifiziert und seine Funktion durch gezieltes Gen-Knockout (KO) des Monooxygenase-Gens SorbC bestätigt, welches zu einem Verlust der Sorbicillinoid-Produktion führte. Wir planen, die Sorbicillin-Biosynthese zur Herstellung neuer bioaktiver Verbindungen zu untersuchen und zu nutzen.Eine grundlegende Frage in der Biosynthese der Sorbicillinoide ist, ob die Dimerisierung von Sorbicillinol-Analoga eine spontane oder enzymkatalysierte 4 + 2-Cycloaddition ist. Wir haben zuverlässige Produktionsbedingungen für Sorbicillinoide und eine effiziente Transformationsmethode für T. reesei entwickelt. Eine effektive Gen-Knockout Methode in T. reesei konnte etabliert werden und wir wollen nun die Funktion jedes Gens im GC untersuchen, um den gesamten Weg zu bestimmen und zu untersuchen wie die Dimerisierung von Sorbicillinol stattfindet, sowie zur Identifizierung biosynthetischer Zwischenprodukte. Darüber hinaus verfügen wir über umfangreiche Expertise in der heterologen Expression von Pilz-Biosynthese-GC unter Verwendung des Wirtspilzes A. oryzae. Wir werden jedes Gen aus dem Biosynthese-GC einzeln klonen und exprimieren, um den gesamten Biosyntheseweg zu bestätigen und um mehr biosynthetische Zwischenprodukte hervorzubringen.Parallel dazu wollen wir die Sorbicillinoid-Biosynthese unter Verwendung von In-vitro- Methoden, wie der Expression von Sorbicillin-Biosynthesegenen in E. coli, untersuchen. Dies ermöglicht es uns die Substratselektivität verschiedener Enzyme, die vom GC codiert werden, unter Verwendung von natürlichen Substraten, die aus Gen-KO und Expressionsexperimenten erzeugt wurden, zu untersuchen und unnatürliche Substrate einzuführen. Sollten wir einen 4+2-Cycloadditionskandidaten aus unserem Gen-Knockout und Expressionsexperimenten identifizieren, so haben wir die Experstise, dieses einzigartige Enzym vollständig biochemisch zu charakterisieren und seine Funktion und Substratselektivität zu bestätigen.Abschließend sollen, durch Kooperationen mit Prof. M. Stadler am HZI und PD. Dr. C. Zeilinger an der LUH, die Sorbicillinoid-Verbindungen in einer Vielzahl biologischer Assays getestet werden. Hierzu gehören alle natürlich vorkommenden Sorbicillinoide, sowie Zwischenprodukte aus Gen-KO / Expression und unnatürlich vorkommende Verbindungen, die aus in-vitro-Enzym-Assays gewonnen wurden. Es soll unter anderem, jedoch nicht ausschließlich, auf Anti-Krebs und antimikrobielle Aktivitäten hin geprüft werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Dr. Elizabeth Skellam