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Projekt
Thiolschalter in Integrinen: ihre molekulare Analyse und redoxregulatorische Auswirkung auf Zell-Matrix-Interaktion und Migration.
Antragsteller
Professor Dr. Johannes Andreas Eble
Fachliche Zuordnung
Biochemie
Zellbiologie
Zellbiologie
Förderung
Förderung von 2017 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 386250640
Integrine sind Zelladhäsionsmoleküle und vermitteln unterschiedliche Funktionen, wie Zellverankerung, Kraftübertragung und Wanderung. Sie sind alpha-beta-Heterodimere, die mittels ihrer Kopfdomäne extrazelluläre Matrixliganden binden und sie über ihre extrazelluläre Stiel- und Transmembrandomänen mit dem intrazellulären Zytoskelett verbinden. Durch dramatische Konformationsänderungen von einer geknickten zu einer gestreckten Form werden Integrine aktiviert und üben ihre Funktion aus. Diese Konformationsänderung beinhaltet eine gegenseitige Bewegung von Kopf- und Stieldomänen um ein Gelenk, das durch die Scharnierregion der alpha Untereinheit gebildet wird. Diese Scharnierregion, und möglicherweise auch die Waden 2-Domäne im Stiel der alpha-Unterheit, enthält einen cysteinbasierten Thiolschalter. Dies erklärt die erhöhte Integrinbindungsaktivität nach Oxidation durch Wasserstoffperoxid in physiologischen Konzentrationen. Beispielhaft zeigten wir, dass die Gelenkregion des alpha7 beta1 Integrins, eines Lamininrezeptors, reversibel redoxmodifiziert wird und an der Redoxregulation von integrinvermittelten Zellfunktionen, z.B. Wanderung, beteiligt ist. Deshalb hängen diese Zellfunktionen von der Redoxumgebung der Zellen ab.In diesem Projekt untersuchen wir die Rolle der redoxaktiven Cysteine in der Waden2-Domäne der Integrin alpha7-Untereinheit durch Punktmutationen. In Zusammenarbeit mit den SPP-Partnern, werden wir Redoxenzyme der Thioredoxinfamilie, die die extrazelluläre Integrindomäne redoxregulieren, identifizieren, um so den Redoxmechanismus aufzuklären. Wir bestimmen in proteinchemischen Tests, Hochauflösung-Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie, in welcher Weise Konformationsänderungen und Kraftübertragung des Integrins von Thiolschalter(n) in der Scharnier- und Waden 2-Domäne abhängen. Auf zellulärer Ebene lassen wir Fibrosarkomzellen und, als Neuerung, Melanomzellen unterschiedliche alpha7 beta1 Mutanten mit deletierten Thiolschaltern exprimieren, nachdem endogenes Integrin durch CRISPR/Cas9-Technologie ausgeschaltet wurde. Andere lamininbindenden Integrine werden durch Antikörper gehemmt. Zusammen mit SPP1710-Partners werden die Zellen auf ihr Repertoire extrazellulärer Redoxenzyme charakterisiert. Unter verschiedenen Redoxbedingungen und in Gegenwart von Redoxenzymen werden an transfizierten Zellen die biologischen Konsequenzen der redoxregulierten Integrinfunktionen, z.B. der Zellspreizung, Adhäsion und Migration, in impedanzbasierten Adhäsions/Migrationstests und durch Video- und Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt. Die Bildung von Adhäsomen, eine weitere Integrinfunktion, wird mittels 2D-DiGE vergleichend untersucht. Translationell werden wir Melanomaspheroide als in vitro-Tumormodell in der Durchflusszytometrie und Echtzeitfluoreszenzmikroskopie nutzen, um herauszufinden, ob und wie das Redoxmilieu im hypoxischen Tumorkern die alpha7 beta1-integrinabhängige Melanomawanderung und -disseminierung beeinflusst.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
