Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Membranproteinen in terminalen Oxidasen und Proteomen ausgewählter Modellorganismen

• Antragsteller: Dr. Julian Langer
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 379643633

Die in diesem Folgeantrag vorgeschlagenen Arbeiten gliedern sich in zwei Teile: Im ersten Teil werden wir unsere Untersuchungen an neuen, kleinen Untereinheiten terminaler Oxidasen fortführen, sowie mittels HDX-MS Liganden-Bindestellen und Konformationsänderungen in Zielproteinen mit Kollaborationspartnern im SPP untersuchen. Im zweiten Teil werden wir die von uns etablierte verdau-freie MS-Methodik weiterentwickeln und explorative Studien zur Identifikation neuer, kleiner Membranproteine in verschiedenen Modellorganismen durchführen.1) Terminale Oxidasen und funktionelle Studien.Terminale Oxidasen sind essentielle Proteine der Atmungskette sowie attraktive Ziele für die antimikrobielle Wirkstoffforschung, da ihre Struktur häufig von den humanen Homologen abweicht. Um diese Proteinkomplexe weiter zu charakterisieren werden wir unsere Untersuchungen neuer, kleiner Untereinheiten ausweiten und zusätzliche Oxidasen verschiedener Organismen, wie E. coli, P. stutzeri und Mycobakterien untersuchen. Mit Hilfe unseres Rapiflex MALDI-TOF/TOF Systems planen wir diese direkt in isolierten Oxidasen zu identifizieren. Ein Schwerpunkt wird dabei die Isoform 2 der E. coli bd oxidase sein, die bereits erfolgreich in unserem Labor aufgereinigt wurde. Ferner werden wir unsere funktionellen Studien an kleinen Untereinheiten der terminalen Oxidasen erweitern. Ein Fokus wird auf der Untereinheit CydH/Ynhf der bd Oxidase (Isoform 1) aus E. coli liegen, die wir in der ersten Förderperiode des SPP2002 identifziert haben. Um die Rolle kleiner Unterheinheiten bei der Assemblierung und Aktivität von Oxidasen zu untersuchen, planen wir genetische Deletionsstämme sowie konditionale Deletionen anzufertigen. Ausserdem werden wir Interaktionsstudien mit getaggten oder über spezifische Antikörper/Nanobodies immobilisierten kleinen Untereinheiten durchführen sowie Quervernetzungs-Ansätzen verfolgen.Zudem planen wir unsere Zielproteine mittels HDX-MS zu untersuchen, um Liganden-Bindestellen zu identifzieren und Konformationswechsel zu verfolgen. Darüberhinaus werden wir diese Technik auch mit Kollaborationspartnern im SPP an den jeweiligen Zielproteinen einsetzen.2) Methodenentwicklung und explorative StudienFerner wollen wir die bisherigen explorativen Studien weiterführen und erweitern. Dies beinhaltet die Methodenentwicklung in Bereich der Massenspektrometrie sowie die Anwendung dieser Methoden auf ausgewählte Zielorganismen. Unser Verdau-freies Top-Down Verfahren werden wir über Ionenmobilität-Massenspektrometrie verbessern, um damit große Peptide in niedrigen Ladungszuständen besser zu detektieren.Diese Verfahren werden wir dann nutzen, um die Proteome von P. stutzeri und E.coli nach weiteren kleinen Membranproteinen zu durchsuchen. Zudem werden wir Proteom-Studien mit genetischen Knock-out Stämmen von kleinen Zielproteinen, die auch in der ersten Förderperiode dieses SPPs identifiziert wurden, unter verschiedenen Bedingungen durchführen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2002: Kleine Proteine in Prokaryoten, eine unbekannte Welt