In-vivo-Bildgebung und optische Manipulation lebender Dünndarmschleimhaut durch 2-Photonenmikroskopie und Femtosekunden-Laserchirurgie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel der interdisziplinären Zusammenarbeit von Medizinern und Physikern war es, aktuelle Möglichkeiten mikroskopischer Bildgebung und optischer Manipulation mit zellbiologisch-immunologischen Untersuchungen an der Darmschleimhaut zu verbinden. Als zentrale Methode wurde die 3D-Mikroskopie mittels Kurzpuls-Lasern auf ein neues in-vivo-Mausmodell angewendet. Hierzu standen mehrere 2-Photonenmikroskope z.T. mit eingekoppelten Manipulationslasern zur Verfügung. Insgesamt konnte das Projekt erfolgreich realisiert werden. Das Arbeitsprogramm wurde in der Mehrzahl der projektierten Punkte umgesetzt, die Mehrzahl der Ziele wurde erreicht und die Ergebnisse wurden umfassend publiziert. Für einen kleinen Teil der experimentellen Ansätze ergaben sich zur Laufzeit methodische Schwierigkeiten, u.a. für die Untersuchungen pathologisch veränderter Darmschleimhaut. Für andere Aspekte, wie die Nutzung der mikroskopischen optischen Kohärenztomographie (m-OCT) oder die in-vivo-Migration von Lymphozyten im Darmepithel, ergaben sich dagegen unerwartete Befunde, die zu inhaltlichen und methodischen Erweiterungen führten. Die methodischen Aspekte des Projekts umfassten die multispektrale Detektion mit erweiterter Infrarot-Bildgebung. Hier wurden für verschiedene Abbildungsmodi (Autofluoreszenz, Farbstoffe, IR, FLIM, SGH, THG) optimierte Parameter ermittelt, um bei minimierten phototoxischen Schäden über möglichst lange Beobachtungszeit spezifische Gewebekomponenten sowie eingebrachte Marker lokalisieren zu können. Dies wurde durch kombinierte Detektion endogener Chromophore und bis zu 3 eingebrachter Farbstoffe erreicht. Zusätzlich wurde die neue Methode der m-OCT in eines der Geräte integriert und erfolgreich zur 3D-Übersichtsmorphologie eingesetzt. Es wurde systematisch nach geeigneten Farbstoffen für 2-Photonenanregung und simultane Detektion von bis zu 4 Signalen gesucht. Zur Verbesserung der Bildqualität bei gekrümmten Gewebsoberflächen wurden adaptive Optiken sowie Methoden zur dynamischen Kompensation des Wellenfrontfehlers entwickelt und erprobt. Zur Erweiterung des Methodenspektrums für die Laser-Nanochirurgie wurden zwei Verfahren etabliert und getestet, mit denen einzelne Zellen des lebenden Darmepithels gezielt zerstört werden können, um migratorische, inflammatorische und regenerative Prozesse bildgebend zu verfolgen. Hierzu wurde ein UV-Dissektionslaser und ein cw-Probenlaser zur Online-Dosimetrie in Rückstreuung in den Fluoreszenz-Detektionsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt, um Radius- Zeitkurven der Blasenoszillation zu rekonstruieren. Diese optischen Methoden wurden auf ein im Rahmen des Projekts entwickeltes in-vivo-Mausmodell angewendet, das es erlaubt, unter kontrollierten Bedingungen 3D-Zeitserien der lebenden Dünndarmschleimhaut über bis zu 8 h aufzuzeichnen. Bewegungsartefakte und Bildrauschen konnten durch speziell entwickelte Algorithmen auf ein Minimum reduziert werden. In diesem Modell wurde die Aufnahme der Tracer UEA-I und OVA über die M-Zellen der Peyer-Plaques in vivo charakterisiert und das Zusammenwirken mit den Fortsätzen von Makrophagen und dendritischen Zellen räumlich verfolgt. In M-Zellen wurden transzelluläre Poren gefunden, durch die nicht nur die Fortsätze dendritischer Zellen, sondern auch CD45+ B-Lymphozyten direkt das Darmlumen kontaktieren. Die Bewegungsmuster von migrierenden Lymphozyten in den Zotten des Darmepithels wurden quantifiziert, und es wurde ein mathematisches Modell für die engmaschige Kontaktierung der Epithelzellen durch Lymphozyten entwickelt. Nach Lasermanipulation einzelner Epithelzellen wurden die Regenerationsvorgänge des Zellverbands sowie Immunantworten in vivo verfolgt. U.a. wurden Zusammenhänge zwischen Pulslänge, Anregungswellenlänge, Blasengröße und Schadensmechanismen analysiert und die Einwanderung von Granulozyten innerhalb weniger Minuten als Reaktion beobachtet.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2008) Femtosecond-laser-induced nanocavitation in water: implications for optical breakdown threshold and cell surgery. Phys Rev Lett 100:038102
Vogel A, Linz N, Freidank S, Paltauf G
- (2011) In vivo spectral imaging of different cell types in the small intestine by two-photon excited autofluorescence. J Biomed Opt 16:116025
Orzekowsky-Schroeder R, Klinger A, Martensen B, Blessenohl M, Gebert A, Vogel A, Hüttmann G
- (2012) Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem Cell Biol. 137:269–278
Klinger A, Orzekowsky-Schroeder R, von Smolinski D, Blessenohl M, Schueth A, Koop N, Hüttmann G, Gebert A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00418-011-0905-0) - (2013) A new nanosecond UV-laser at 355 nm: early results of corneal flap cutting in a rabbit model. Invest Ophthalmol Vis Sci 54:7854–7864
Trost A, Schrödl F, Strohmaier C, Bogner B, Runge C, Kaser-Eichberger A, Vogel A, Linz N, Freidank S, Hilpert A, Zimmermann I, Grabner G, Reitsamer HA
(Siehe online unter https://doi.org/10.1167/iovs.13-12580) - (2014) Alternativen zur Femtosekundentechnologie: UV Subnanosekundenpulse und Ringfoki für LASIK Flaperzeugung. Ophthalomologe 111:531–538
Vogel A, Freidank S, Linz N
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00347-013-2994-8) - (2014) Data-adaptive image-denoising for detecting and quantifying nanoparticle entry in mucosal tissues through intravital 2-photon microscopy. Beilstein J Nanotechnol 5:2016–2025
Bölke T, Krapf L, Orzekowsky-Schroeder R, Vossmeyer T, Dimitrijevic J, Weller H, Schüth A, Klinger A, Hüttmann G, Gebert A
(Siehe online unter https://doi.org/10.3762/bjnano.5.210) - (2014) Probing the immune and healing response of murine intestinal mucosa by timelapse 2-photon microscopy of laser-induced lesions with real-time dosimetry. Biomed Opt Expr 5:3521–3540
Orzekowsky-Schroeder R, Klinger A, Freidank S, Linz N, Schüth A, Eckert S, Hüttmann G, Gebert A, Vogel A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1364/BOE.5.003521) - (2015) Intravital autofluorescence 2-photon microscopy of murine intestinal mucosa with ultra-broadband femtosecond laser pulse excitation: image quality, photodamage, and inflammationstate. J Biomed Opt 20:116001, 1–13
Klinger A, Krapf L, Orzekowsky-Schroeder R, Koop N, Vogel A, Hüttmann G
(Siehe online unter https://doi.org/10.1117/1.JBO.20.11.116001) - (2016) Wavelength dependence of femtosecond laserinduced breakdown in water, and implications for laser surgery. Phys Rev B 93:004100, 1–19
Linz N, Freidank S, Liang XX, and Vogel A
(Siehe online unter https://doi.org/10.1103/PhysRevB.94.024113)
