DNA-katalysierte Verknüpfungs-Cyclisierungs-Reaktionen: Entwicklung einer hochselektiven, signalamplifizierenden Methode für die Mutationsanalyse
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In der Förderperiode widmete sich eine wachsende Anzahl an Arbeiten der Erprobung von nucleinsäurekontrollierten chemischen Reaktionen in der Nucleinsäureanalytik. Nachweisverfahren, die auf templatkontrollierten Reaktionen basieren, weisen sehr hohe Sequenzspezifitäten weisen. Zudem können DNA/RNA-Template katalytische Wirksamkeit erlangen, so dass ein Templatmolekül die Bildung mehrerer Produktmoleküle herbeiführt, was die Empfindlichkeit des DNA/RNA-Nachweissystems erhöht. Im Forschungsvorhaben wurde u.a. ausgelotet, ob eine fluoreszenzdetektierte Verknüpfung von PNA- Sonden die hochselektive Detektion von DNA in der realtime PCR-Analyse gestattet. Durch Verwendung von β-Aminosäurethioestern konnten bei optimierter Templatarchitektur Hintergrundreaktionen, die bei den hohen Temperaturen der PCR üblicherweise auftreten, minimiert werden, ohne die sehr hohe Geschwindigkeit der templatkontrollierten Reaktion zu beeinträchtigen. Die Praktikabilität wurde anhand der Typisierung der T1799A-Punktmutation im Braf-Gen in genomischer DNA (MT-MEL) geprüft. Eine Menge von 30 Templamolekülen genügte, um ein Signal zu detektieren. Eine solch hohe Empfindlichkeit war templatkontrollierten Reaktionen bislang verwehrt. Beachtung verdient auch die hohe Sequenzspezifität. Selbst bei 1000-fach erhöhter Menge fand die Reaktion auf dem einzelbasenfehlpaarenden Templat nicht statt. Diese enorme Sequenzspezifität ist das Resultat einer chemischen Verknüpfungsreaktion, die hier erstmals während der PCR geführt werden konnte. Am Beispiel von Templaten aus dem Chorea Huntington-Gen wurde gezeigt, dass die Reaktivitätskontrolle, die durch DNA-Template ausgeübt wird, Hinweise auf die Anzahl von Sequenzwiederholungseinheiten liefern kann. Es wurden Bedingungen identifiziert, bei denen signifikante Produktausbeuten erzielt wurden, wenn die Anzahl der Triplettwiederholungen einen kritischen Schwellenwert von 35 überschreitet. Als problematisch erwiesen sich die wechselseitige Erkennung der Reaktivsonden, sowie die Neigung zur Bildung von Überstrukturen im Templat. Dies führte dazu, dass die effektive Konzentration ab einer kritischen Templatlänge abnimmt. Durch die Verwendung von aminomodifizierten PNA-Oligomeren konnte die wechselseitige Erkennung der Reaktivsonden verhindert und gleichzeitig die Templataffinität erhöht werden. Positiv wirkte sich die Einbeziehung von Oligonucleotidblockern aus. Diese brechen die Überstruktur des Templats auf und verwehren den Reaktivsonden den Zugang für den Fall, dass die Triplettanzahl dem Wildtyp-Bereich entspricht. In einem praxisnahen Test führte die Reaktion an Templaten aus der PCR einer anonymisierten DNA-Probe eines Patienten mit Chorea-Huntington zu einer 6-fach höheren Produktmenge als die Reaktion an Wildtyp-DNA. Die katalytische Wirksamkeit in templatkontrollierten Verknüpfungsreaktionen wird durch die Produktinhibierung erschwert. Wir zeigten, dass eine Sequenz aus Native Chemical Ligation und nucleophiler Thiol-Alkylierung zu cyclischen Produkten führt. Diese haben eine verminderte Affinität für das Templat. Anhand eines Vergleichs der Reaktionen von „konventionellen“ Sonden, die nicht cyclisieren können, mit Sonden, die zu einer Ligierungs-Cyclisierungs-Reaktion befähigt sind, wurden die Vorteile des Cylisierungsschritts belegt. Bei Einbeziehung der Cyclisierung an substöchiometrischen Templatmengen wurde dreimal so viel Produkt gebildet. Dieser Trend konnte sowohl bei isothermalen Bedingungen als auch, erstmalig, bei Thermocycling verzeichnet werden. Wir gehen davon aus, dass die Produktcyclisierung eine generell anwendbare Methode ist, um die Templataffinität von Produkten deutlich zu reduzieren und damit die katalytische Wirksamkeit zu fördern. So sollten Nicht-Verknüpfungsreaktionen (vide infra), bei denen die Reaktionsprodukte per se mit ähnlicher Affinität binden wie die Eduktsonden, von einer Cyclisierung im besonders hohen Masse profitieren. In Arbeiten, die über das beantragte Maß hinausgingen, suchten wir nach Reaktionen, bei denen die Länge der Sonden unverändert bleibt. Wir entwickelten Reaktionen, durch die Reportergruppen von einer Reaktivsonde auf eine andere übertragen werden. Beispielhaft ist eine DNA-kontrollierte Dabcylübertragungsreaktion, die > 400 Turnover bei 0.0001 Äquivalent Templat lieferte. Mit Berichten über RNA-gesteuerte Biotinylierungs- und DNA-gesteuerte Fluorophorübertragungsreaktion an PNA- und DNA- Sonden validierten wir die universelle Anwendbarkeit. Übertragungsreaktionen sind nicht auf den Acyltransfer beschränkt. Eine templatkontrollierte Wittig-Reaktion erlaubte die Übertragung einer Benzylidengruppe, wodurch ein Stilben-Fluorophor de novo synthetisiert wurde. Eine konsekutive Erkennung des neu gebildeten Stilbens durch einen zugesetzten Rezeptor (Cyclodextrin) verstärkte das ausgelesene Signal, so dass 0.1 Äquiv. Templat zu einer mehr als 100-fachen Intensivierung der Fluoreszenz führte. Die templatgesteuerte Wittig-Reaktion verläuft mit geringer Hintergrundrate und ermöglicht das Auslesen der Fluoreszenzsignale binnen Minuten. Der vorgestellte Reaktionsaufbau dürfte nur eine von vielen Möglichkeiten darstellen, eine Signalverstärkung in konsekutiven Reaktionen zu ermöglichen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- "Achieving Turnover in DNA-templated Reactions". ChemBioChem 2008, 9, 2185-2192
T. N. Grossmann, A. Strohbach, O. Seitz
- "Single Nucleotide Specific Detection of DNA by Native Chemical Ligation of Fluorescence labeled PNA-Probes". Med. Chem. 2008, 16, 65-77
C. Dose, O. Seitz
- “Target-catalyzed transfer reactions for the amplified detection of RNA". Angew. Chem. 2008, 120, 7228-7231; Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7119-7122
T. N. Grossmann, L. Röglin, O. Seitz
- "Bioorthogonal reactions challenged: DNA templated native chemical ligation during PCR". Chem. Sci.. 2013, 4, 432-436
A. Roloff, O.Seitz
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c2sc20961f) - "The role of reactivity in DNA-templated native chemical ligation during PCR". Med. Chem. 2013, 21, 3458-23464
A. Roloff, O. Seitz
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bmc.2013.04.064) - „Reducing product inhibition in nucleic acid templated ligation reactions: DNA-templated cyclication“. ChemBioChem, 2013, 14, 2322-2328
A. Roloff, O. Seitz
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/cbic.201300516)
