Fine-tuning the glycerol biosynthetic pathway in Saccharomyces cerevisiae to optimize the biotechnological production of bio-fuel ethanol and L-glycerol 3-phosphate (L-G3P)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Mittelpunkt des Forschungsprojektes standen der Syntheseweg von L-Glycerol-3-Phosphat bzw. Glycerol in der Hefe Saccharomyces cerevisiae und zwei biotechnologische Anwendungen, die mit diesem Stoffwechselweg in Verbindung stehen: i) die Produktion von Bioethanol und ii) die Herstellung von L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P). In Bezug auf die Produktion von Bioethanol war es von Interesse, die Synthese von Glycerol zu reduzieren, da es ein unerwünschtes Nebenprodukt darstellt, dessen Bildung die Ethanolausbeute reduziert. Eine vollständige Ausschaltung der Glycerolbildung hat für die Hefezelle allerdings äußerst negative Auswirkungen (kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen und fehlende Osmotoleranz), wie man anhand der ∆gpdl ∆gpd2 Doppelmutante sehen kann, der jegliche Restaktivität des Schlüsselenzyms der Glycerolbildung (Glycerol-3-Phosphatdehydrogenase; GPD) fehlt. Daher war die Überlegung des Forschungsantrages, die Glycerolbildung nur so weit zu reduzieren, dass die negativen Auswirkungen toterierbar bleiben. Angriffspunkt für die stufenweise Reduzierung der Glycerolbildung war die Aktivität des Enzyms GPD (Isoenzyme: Gpd1 und Gpd2). Stämme mit graduell reduzierter Gpd1- bzw. Gpd2-Aktivität (sowie Kombinationen aus beiden) wurden erstellt und sowohl in Batch-Fermentationen im Labormaßstab als auch im Bioreaktor sorgfältig charakterisiert. Bei diesen Studien kamen sowohl synthetische Medien als auch praxisrelevante Weizenhydrolysate zum Einsatz. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die hier verwendete Strategie tatsächlich in der Lage war, die Ethanolausbeute zu erhöhen ohne die Stresstoleranzen wesentlich zu beeinflussen. Zukünftige Arbeiten müssten sich darauf konzentrieren, den Bedarf an NADH-Reoxidation auf geeignetem Wege zu reduzieren, damit die Ethanolproduktionsrate noch weiter erhöht erden kann. Der zweite Teil des Projektes betraf die Produktion von L-G3P. In vorangegangenen Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass dieser Metabolit durch entsprechendes Metabolie Engineering in der Hefezelle angehäuft werden kann. Dies geschieht hauptsächlich durch Ausschaltung der Aktivität der Glycerol-3-Phosphatase (GPP), welches für die spezifische Dephosphorylierung von L-G3P zu Glycerol verantwortlich ist (Isoenzyme Gppl und Gpp2). Überraschenderweise bildete die ∆gpp1 ∆gpp2 Doppelmutante immer noch erhebliche Mengen an Glycerol. Die Arbeiten innerhalb des Projektes sollten der Aufklärung und Ausschaltung des bisher unbekannten alternativen Stoffwechselweges dienen. Hierzu wurde zunächst eine vergleichende Transkriptomanalyse (∆gpp1 ∆gpp2 Doppelmutante versus isogener Wildtyp) durchgeführt. Diese sollte Hinweise auf höher exprimierte Phosphatasen bzw. auf andere Enzyme geben, die unter den spezifischen Bedingungen in der Mutante zur Bildung von Glycerol beitragen könnten. Unter den signifikant in ihrer Expression veränderten Genen in der Mutante wurden auffallende viele Überlappungen gefunden mit zwei früheren Expressionstudien anderer Autoren, die unter Phosphatlimitation durchgeführt wurden. Dies unterstützt die Hypothese, dass es in der Mutante durch die starke L-G3P Akkumulation zu einer Verarmung an intrazellulärem anorganischem Phosphat kommen könnte. Zudem wurden auffällig viele Oxidoreduktasen in ihrer Expression verändert, was der Akkumulation von NADH in der Mutante geschuldet sein könnte und auf eine Funktion der intrazellulären Redoxbalance als Trigger für die Genregulation hindeutet.Einige der interessanten Kandidatengene (u.a. DOG1, D0G2, DAK2, GCV1), die aus der Expressionsstudie hervorgingen, wurden deletiert. Die bisher durchgeführten Deletionen (einzeln und in Kombination) führten jedoch nicht zu einer Reduktion der Glycerolbildung in der ∆gpp1 ∆gpp2 Doppelmutante.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2008) Fermentative production of L-glycerol 3-phosphate utilizing a Saccharomyces cerevisiae strain with engineered glycerol biosynthetic pathway. Biotechnol. Bioengineering 100, 497-505
Popp, A., Nguyen, H.T.T., Boulahya, K., Bideaux, C, Alfenore, S., Guillouet, and Nevoigt, E.
- (2010) Quantitative evaluation of yeast's requirement for glycerol formation in Very High Ethanol Performance fed-batch process. Microb. Cell Fact. 9, 36-48
Pagliardini, J., Hubmann, G., Bideaux, C., Alfenore, S., Nevoigt, E., Guillouet, S. E.
- (2011) Gpd1 and Gpd2 fine tuning for sustainable reduction of glycerol formation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 77, 5857-5867
Hubmann, G., Guillouet, S., Nevoigt, E.
- (2013) The metabolic costs of improving ethanol yield by reducing glycerol formation capacity under anaerobic conditions in Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 12, 29-42
Pagliardini, J., Hubmann, G., Alfenore, S., Nevoigt, E., Bideaux, C, Guillouet, S.E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1186/1475-2859-12-29)
