Bedeutung der proteolytischen Regulation des epithelialen Natriumkanals ENaC durch Serinproteasen in vivo

• Antragsteller: Professor Dr. Ferruh Artunc
• Fachliche Zuordnung: Nephrologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 360658146

Der epitheliale Natriumkanal (ENaC) findet sich im spätdistalen aldosteron-sensitiven Tubulus und bestimmt die finale Natriumausscheidung im Urin. Aufgrund dieser essenziellen Bedeutung für den Natriumhaushalt wird die ENaC-Aktivität durch eine Vielzahl von Faktoren zum Teil redundant reguliert. Innerhalb der verschiedenen Regulationsmechanismen ist die Aktivierung durch proteolytische Spaltung besonders potent. Intra- und extrazelluläre Serinproteasen führen zu einer Entfernung von inhibitorischen Peptiden aus der α- und der γ-Untereinheit, sodass auf Einzelkanalebene eine sehr hohe Offenwahrscheinlichkeit resultiert. Während die proteolytische Regulation des ENaC durch extrazelluläre Serinproteasen in vitro gut untersucht ist, gibt es nur wenige Daten zur in vivo Existenz und Relevanz dieser Regulation. Einen indirekten Hinweis auf die Bedeutung der proteolytischen ENaC-Regulation konnte der Antragsteller durch Behandlung von Mäusen mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin aufzeigen, die einen verminderten ENaC-spezifischen Natriumtransport aufwiesen. Bei proteinurischen Mäusen hemmte Aprotinin die Urin-Serinproteaseaktivität und verhinderte damit eine ENaC-vermittelte Natrium-Retention und Ödementstehung. Weder durch den Antragsteller noch in der Literatur konnte ein überzeugender Nachweis über die proteolytische Aktivierung der γ-Untereinheit in Nierengewebe von sowohl Mäusen als auch Menschen erbracht werden, so dass es bislang keine gute Evidenz für die Existenz der proteolytischen Regulation in vivo gibt. In dem vorliegenden Antrag soll das Vorhandensein und die Bedeutung der proteolytischen ENaC-Regulation in vivo, mit Augenmerk auf die Identifikation möglicher beteiligter Proteasen, erforscht werden. Dazu sollen Schnittstellen-spezifische γ-ENaC-Antikörper generiert werden, um den Nachweis der proteolytischen Spaltung im Gewebe zu erbringen. Des Weiteren soll ein fluoreszenz-markiertes Peptid-Substrat eingesetzt werden, das der Sequenz der Schnittregion des γ-ENaC entspricht. Durch Inkubation dieses Substrats mit Serinproteasen entweder in gereinigter Form oder aus Urinproben kann die proteolytische Aktivität gegen γ-ENaC untersucht und die Identität der beteiligten Proteasen aufgeklärt werden. Schließlich soll eine γ-ENaC-knockin-Maus generiert werden, bei der die putative Schnittstelle für Serinproteasen im γ-ENaC-Gen mutiert werden soll (RKRK186AAAA), sodass eine proteolytische ENaC-Aktivierung nicht mehr stattfinden kann. Durch Phänotypisierung dieser Maus sowohl unter physiologischen (Niedrigsalzdiät, Diuretika) als auch pathophysiologischen Bedingungen (nephrotisches Syndrom) soll die Bedeutung der proteolytischen ENaC-Aktivierung in vivo nachgewiesen werden. Dies und die mögliche Identifikation der beteiligten Serinproteasen könnten die Grundlage für eine therapeutischen Ansatz zur Hemmung der proteolytischen ENaC-Aktivierung in vivo legen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen