Rekonstitution der enzymatischen Biosynthese des antimikrobiellen Peptides Microcin J25
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses DFG-Antrags wurde versucht die Biosynthese von Lassopeptiden besser zu verstehen und in vitro zu charakterisieren. Der einzig bekannte Lassopeptidbiosynthesecluster zu Beginn dieser Arbeiten war der Cluster aus E. coli AY25, der für die Reifung von MccJ25 aus McjA verantwortlich ist. Dabei war bekannt, dass es sich bei McjB und McjC um die Prozessierungsenzyme handelt, während McjD für den Export des reifen Lassopeptids zuständig ist. Nicht bekannt war, welches der beiden Enzyme, McjB und McjC, welchen Schritt der Prozessierung katalysierte. Diese Schritte sind zum Einen die Hydrolyse des Vorläuferpeptids, zum Anderen die Seitenkettenaktivierung des Glutamats samt der anschließenden Ausbildung des Makrolaktamrings. Im Rahmen dieses Antrags gelang in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Rebuffat die Expression und Aufreinigung von McjB und McjC, sowie die Isolation des Vorläuferpeptids McjA aus Zellkulturen. Mit den rekombinanten Enzymen und dem Vorläuferpeptid konnte in vitro die Maturation zu MccJ25 beobachtet und untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl McjB als auch McjC ATP-abhängig sind. Weiter wurde bewiesen, dass McjB für die Spaltung von McjA zuständig ist, während McjC die Seitenkettenaktivierung und den Ringschluss katalysiert. Die ATP-Abhängigkeit von McjB ist noch nicht vollständig verstanden, könnte aber ein Hinweis auf eine Chaperoneigenschaft dieses Enzyms sein. Zusätzlich wurde im Rahmen dieses Antrags ein neues Lassopeptid, Capistruin, durch Genomisches Mining vorhergesagt, isoliert und der zugehörige Biosynthesecluter identifiziert. Bei dem Cluster CapABCD handelt es sich um den zweiten bisher bekannten Lassopeptidbiosynthesecluster. Durch Mutageneseexperimente konnten zunächst für die Biosynthese wichtige Positionen innerhalb der Lassopeptidsequenz in vivo identifiziert werden. Dem Microcin-System analoge in vitro Charakterisierungen konnten bisher nicht durchgeführt werden, da es für die Enyzme aus dem Capistruin-System noch nicht gelungen ist, die Expression so zu optimieren, dass die schwerlöslichen Prozessierungsenzyme CapB und CapC rekombinant hergestellt und isoliert werden konnten. Zusammenfassend wurde das Ziel der grundlegenden in vitro Charakterisierung des Microcin-Systems erreicht, während sich durch Identifikation und Isolation von Capistruin samt seines Biosyntheseclusters die Möglichkeit eröffnete, die Lassopeptidbiosynthese auch in einem weiteren System zu untersuchen. Dadurch wird es in Zukunft möglich werden, die Gemeinsamkeiten und Unterschiede beider Systeme zu vergleichen. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeiten ein allgemeines Vorgehen zur Identifikation neuer putativer Lassopeptidbiosyntheseclustern sowie deren Isolation und Strukturaufklärung entwickelt.
Publications
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(2008). Isolation and structural characterization of capistruin, a lasso peptide predicted from the genome sequence of Burkholderia thailandensis E264. J. Am. Chem. Soc. 130: 11446-11454
Knappe, T.A., Linne, U., Zirah, S., Rebuffat, S., Xie, X. and Marahiel, M.A.
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(2009). Insights into the iosynthesis and stability of the lasso peptide capistruin. Chem. Biol. 16: 1290-1298
Knappe, T.A., Linne, U., Robbel, L. and Marahiel, M.A.
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(2012). Dissection of maturation steps of the lasso peptide microcin J25 in vitro. ChemBioChem, 13: 1046-52
Kok-Phen Yan,Yanyan Li, Séverine Zirah,Christophe Goulard,Thomas A. Knappe, Mohamed A. Marahiel, and Sylvie Rebuffat
