Quantitative Mikroskopie auf Basis der Photonen-Statistik (PhotoQuant)

• Antragsteller: Professor Dr. Hans-Robert Volpp, seit 8/2019
• Fachliche Zuordnung: Analytische Chemie ; Biophysik ; Optik, Quantenoptik und Physik der Atome, Moleküle und Plasmen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 341878689

Quantitative Informationen sind für das Verständnis molekularer Prozesse in lebenden Organismen essentiell. Methoden zur Bestimmung der Anzahl einzelner Biomoleküle in Strukturen oder Reaktionen sind deshalb unerlässlich. Idealerweise sollen solche Methoden absolute Zahlen liefern, minimal invasiv sein und somit in situ-Messungen in lebenden Proben ermöglichen. Zusätzlich sind eine geringe Messzeit und ein nicht destruktiver Zählprozess für wiederholte Messungen und die Untersuchung dynamischer Prozesse erforderlich. Es sind bereits verschiedene fluoreszenzbasierte Ansätze zum Zählen auf molekularer Ebene bekannt, jedoch erfüllt keiner dieser Ansätze die eingangs genannten Anforderungen vollständig. Wir haben bereits gezeigt, dass die in der Photonenemissionsstatistik enthaltenen Informationen dazu genutzt werden können, die Anzahl an Fluorophoren in beugungslimitierten Strukturen mit hoher Genauigkeit zu bestimmen (counting by photon statistics - CoPS). Aktuell erlaubt die CoPS-Methodik nicht-destruktive Messungen mit hoher Zeitauflösung und erweitertem Zählbereich in vitro.Um in situ-Messungen in biologischen Proben zu ermöglichen, möchten wir die CoPS-Methodik erweitern und so den erhöhten Anforderungen solcher Systeme gerecht werden. Zunächst planen wir eine Erweiterung der momentan implementierten Punktmessroutine von einfarbiger Anregung hin zu einer pulsalternierenden Anregung in zwei Farbkanälen. Dies umfasst die Erweiterung eines existierenden Aufbaus sowie eine Änderung der Ansteuerungselektronik und der Datenanalyseroutine. Im Weiteren soll der Einfluss störender Effekte in biologischen Systemen, wie ein erhöhtes Hintergrundsignal oder Emitterinteraktionen, auf die Photonenstatistik experimentell und durch Simulationen untersucht werden. Die etablierten Ansätze sollen genutzt werden, um zwei biomedizinische Modellsysteme zu untersuchen. Zum einen soll die Zusammensetzung des T-Zellrezeptorclusters unter Einfluss des HIV-Effektorproteins Nef, zum anderen die Komplexbildung des Interferon alpha Rezeptors und der zugehörigen Kinasen untersucht werden. Eine fluoreszente Markierung der Zielproteine soll über enzymatische Proteintags wie dem HaloTag erfolgen. Posttranslationale Modifikationen sollen mittels monoklonaler Antikörper markiert werden. Das Verhältnis zwischen gemessenen Emittern und der zugrundeliegenden Anzahl an Zielproteinen soll durch eingehende Charakterisierung des erreichten Markierungsgrades bestimmt werden.Zuletzt sollen technischen Anforderungen für eine Weiterentwicklung von punktbasiertem CoPS zu einer bildgebenden Technik untersucht werden. Hierfür soll eine Machbarkeitsstudie mit einer emCCD-Kamera durchgeführt werden und definierte Proben vermessen werden sowie ein theoretisches Modell zur Analyse ortsaufgelöster Photonenstatistiken entwickelt werden. Zusätzlich soll die Eignung alternativer Detektoransätze wie z. B. APD-Arrays für bildgebendes CoPS mit verbesserter Zeitauflösung untersucht werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Ehemaliger Antragsteller: Professor Dr. Dirk-Peter Herten, bis 7/2019