Photo Cross-linking/mass spectrometry (CLMS) --- Eine neue Technologie zur Bestimmung von Proteinstrutkuren

• Antragsteller: Professor Dr. Oliver Brock; Professor Dr. Juri Rappsilber
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Analytische Chemie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 329673113

Viele Proteine können mit etablierten Strukturbestimmungsmethoden nicht untersucht werden. Im Rahmen dieses Projektes soll eine neue Methode für die Strukturbestimmung dieser Problemklassen entwickelt werden. Die vorgeschlagene Methode basiert auf Cross-link/Mass spectrometry (CLMS) Daten mit hoher Dichte und maßgeschneiderten Algorithmen um diese zu interpretieren. Dieses Projekt adressiert drei Maßnahmen um Cross-linking für die Strukturbestimmung zu verbessern: 1) Die Erhöhung der CLMS Datendichte, 2) die Verbesserung der CLMS Datenverteilung, 3) die Kombination von hoch-Dichte CLMS Daten mit maßgeschneiderten Algorithmen zur Suche im Konformationsraum. Um die Dichte der CLMS Daten zu erhöhen, werden wir die Effektivität verschiederer Fragmentierungsmethoden in Kombination mit reaktiven Cross-link Reagenzien, wie dem diazirine-basierenden Cross-linker sulfo-SDA, analysieren. Dieses Vorhaben benötigt die Etablierung von neuen Protokollen für die Massenspektrometrie und weitere Anpassungen in der algorithmischen Interpretation von Peptid- und Fragmentierungsspektren. Ferner postulieren wir einen Graph-basierenden Algorithmus um die Relation zwischen cross-links für die Verbesserung der Datenqualität zu nutzen.Wir adressieren momentane Limitationen Trypsin basierender Verdauungsmethoden um die Verteilung der CLMS Daten zu verbessern. Trypsin basierende Verdauung erzeugt bei ungünstiger Verteilung von Verdauungsschnittstellen Peptide, welche zu klein oder zu groß für die massenspektrometrische Analyse sind. Dieses Projekt testet alternative Proteasen mit anderen Verdauungsschnittstellen sowie unspezifische Proteasen um die gleichmäßige Verteilung von Cross-links sicherzustellen. Weiterhin werden wir Verdauungsprotokolle mit mehreren Proteasen testen und die massenspektrometrische Analyse für diese Proteasen optimieren. Weiterhin werden wir maßgeschneiderte Algorithmen für die Strukturmodellierung mit CLMS Daten entwickeln. Dazu entwickeln wir Algorithmen die in der Lage sind Strukturinformationen mit Hilfe von CLMS Daten aus Strukturdatenbanken zu gewinnen, welche die CLMS Daten komplementieren. Ferner entwickeln wir Strukturmodellierungsalgorithmen die gegenüber fehlerhaften CLMS Daten robust sind. Dies wird durch Suchalgorithmen erreicht, welche die automatisch die Qualität der CLMS Daten bewerten und während der Suche fehlerhafte Daten zurückweisen.Die vorgeschlagene Methode soll rigoros im Rahmen des 13ten Critical Assessment of protein Structure Prediction (CASP) Experimentes validiert werden. Wir werden Proteine mit unbekannter Struktur analysieren und die CLMS Daten für die Validierung unserer Strukturmodellierungsalgorithmen nutzen. Weiterhin werden die CLMS Daten innerhalb des CASP Experimentes für andere Strukturvorhersagegruppen zugänglich gemacht um die Reichweite dieses Projektes zu maximieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen