Quantitative Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie mit Mehrfarbendetektion basierend auf der Analyse der "blinking"-Zyklen von Fluorophoren

• Antragsteller: Professor Dr. Mike Heilemann
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Physikalische Chemie von Molekülen, Flüssigkeiten und Grenzflächen, Biophysikalische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 316699192

Wir werden ein Verfahren zur hochauflösenden Einzelmolekülmikroskopie und gleichzeitiger Ermittlung quantitativer Information auf der Nanoscala entwickeln ("quantitative single-molecule localization microscopy", qSMLM). Dieses Vorhaben basiert auf der Natur der Rohdaten der Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie, welche die Koordinaten einzelner Fluorophore räumlich und zeitlich bestimmt. Diese Daten werden in den meisten Fällen zur Erzeugung eines räumlich höchstaufgelösten Bildes verwendet. Durch die zeitliche Auflösung sind jedoch auch kinetische Informationen zugänglich, bspw. zu Fluoreszenzzyklen und insbesondere zum "Blinken" einzelner Fluorophore. Letztere sind durch kinetische Modelle sehr gut beschreibbar, und können auch auf molekulare Komplexe bestehend aus mehreren Fluorophoren erweitert werden. In diesem Vorhaben beabsichtigen wir die Entwicklung von Mehrfarben-qSMLM, d.h. der gleichzeitigen (i) höchstauflösenden Bildgebung mittels Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie und (ii) Quantifizierung von Proteinkomplexen basierend auf der Analyse der "Blink"-Kinetik einzelner Fluorophore. Hierzu werden wir die Photokinetik verschiedener organischer Fluorophore als auch fluoreszierender Proteine auf Einzelmolekülebene untersuchen, und geeignete Kalibrierungsstandards einsetzen. Insbesondere werden wir den Einfluss der Nanoumgebung auf die Photokinetik untersuchen, und Experimente in Zellen durchführen. Diese "molekulare Quantifizierung" stellt eine einfache und überaus nützliche Erweiterung der hochauflösenden Einzelmolekülmikroskopie dar, und ist in großer Breite einsetzbar -- bspw. zur Untersuchung von homo- und heterooligomeren Proteinkomplexen in intakten Zellen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen