Steuerung der Kanaluntereinheit Kir6.1 des rekombinanten vaskulären KATP-Kanals (Kir6.1/SUR2B) durch Nukleotide, Lipide und cAMP-abhängige Phosphorylierung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel dieses Projektes war zweifach: Wir wollten zunächst die Aktivierung des Kir6.1/SUR2B Kanals durch Nukleotide bei 37 °C im isolierten Patch messen und mit den Daten bei Raumtemperatur vergleichen. Im zweiten Schritt sollte durch Chimärenbildung und Aminosäureaustausch mit Kir6.2 die strukturelle Ursache für die unterschiedliche Steuerung der beiden Kir6.x Subtypen gefunden werden. Es wurde zunächst ein Heizsystem gebaut, das am Patch bei Überströmung eine konstante Temperatur von 37 °C garantierte. Damit konnten wir den Effekt der Temperaturerhöhung von 22 auf 37 °C auf die Hemmung des Kir6.2/SUR2B Kanals durch MgATP zeigen: Bei 37°C war die aktivierende Komponente von MgATP viel stärker und die Hemmung zeigte eine deutliche Kooperativität. Im Gegensatz zu den Vorarbeiten (die bei 30- 32 °C) durchgeführt worden waren, zeigte sich jetzt in Gegenwart von MgATP ein sehr starker Rundown (nach ~3 min war im allgemeinen kein KATP-Strom mehr meßbar) sowie erratische Leckströme, die eine quantitative Auswertung extrem erschwerten. Es ist offensichtlich, daß ein metabolisch (d.h. durch intrinsische ATPase-Aktivität) regulierter Kanal bei 37 °C untersucht werden sollte; wegen der o.g. Schwierigkeiten mußten wir jedoch aufgeben. Es wurden noch Kir6.x-Mutatanten mit hoher Offenwahrscheinlichkeh (Kir6.2(V59G) und Kir6.1(I60G)) und eine SUR2B-Mutante mit einer - wenn überhaupt - äußerst geringen ATPase-Aktivität (SU2B(K707R, K1348R)) charakterisiert. Um die Struktur-Funktionsbeziehungen am KATP-Kanal zu erweitern haben wir weitere Mutanten charakterisiert, so SUR1(Q1178R), in der der posthydrolytische Zustand stabilisiert ist und eine SUR2B-Mutante in der die Transmembrandomäne 0 abgeschnitten wurde, die aber immer noch an den Kir6.2 koppeln kann ohne einen funktionstüchtigen Kanal auszubilden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Analysis of two KCNJ1 1 neonatal diabetes mutations, V59G and V59A, and the analogous KCNJ8 I60G substitution: Differences between the channel subtypes formed with SUR1. J Biol Chem 284, 6752-6762
Winkler M, Lutz R, Russ U, Quast U, Bryan J
- Incomplete dissociation of glibenclamide from wild-type and mutant pancreatic KATP channels limits their recovery from inhibition. Br J Pharmacol 156, 354-361 (2009)
Russ U, Kühner P, Prager R, Stephan D, Bryan J, Quast U
