Den Kreis schließen - Optogenetische Kontrolle von Ca2+-Freisetzung aus und Wiederaufnahme in das endoplasmatische Retikulum

• Antragsteller: Professor Dr. Alexander Gottschalk; Professor Dr. Stephan E. Lehnart; Professor Dr. Philipp Sasse
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Anatomie und Physiologie ; Kardiologie, Angiologie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315402240

In elektrisch erregbaren Zellen sind intrazelluläre Ca2+-Freisetzung und -Aufnahme aus dem endo/sarkoplasmatischen Retikulum (ER/SR) via Ryanodine-Rezeptoren (RyR) und SERCA-Ca2+-ATPasen funktional gekoppelt. Dies ermöglicht eine strenge raumzeitliche Kontrolle lokaler Ca2+-Signale (Ca2+ Sparks) und sichert das Überleben von Zellen durch niedrige Ca2+-Spiegel im Ruhezustand. Trotz der prominenten Rolle des RyR-Ca2+-Kanals und der SERCA Ca2+-Pumpe im Gehirn, Herzen, Pankreas und Skelettmuskel, ist ihre gezielte molekulare Manipulation eine Herausforderung. Zum Beispiel verursachen RyR2-Patientenmutationen lebensbedrohliche Arrhythmien durch erhöhten Ca2+-Leak im Herzen. In Zellmodellen hingegen wird ein Ca2+-Leak vor allem durch nicht-physiologische, pharmakologische Substanzen simuliert auf Kosten pleiotroper unspezifischer Nebeneffekte. Das Fehlen von Werkzeugen zur gezielten Manipulation von RyR und SERCA verzögert auch die Arzneimittel-Entwicklung für eine Vielzahl von Krankheiten wie Arrhythmien, Krebs, kognitive Dysfunktion, Diabetes, Epilepsie, Herzinsuffizienz und Muskelerschöpfung. Obwohl die Entwicklung optogenetischer Tools zur Manipulation von RyR-Kanälen und SERCA-Pumpen sehr herausfordernd ist, wäre die Entwicklung eines OptoRyR-Tools nicht nur vielversprechend, sondern würde neue konzeptionelle Strategien zur Medikamententestung eröffnen.In der ersten Förderperiode haben wir neue Strategien zur lichtinduzierten Ca2+-Freisetzung entwickelt. Die erfolgreichste Strategie verwendete eine Ca2+-leitfähige Channelrhodopsin2-Variante in einem RyR2-Fusionsprotein. Dieses OptoRyR2 Protein nutzt den endogenen Verstärkermechanismus der Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung durch zytosolische Aktivierung des RyR2-Kanals.Für die zweite Förderperiode werden wir diese Konzepte in drei wesentliche Richtungen weiterentwickeln: Ziel 1 soll das Opto-RyR2-Konzept auf C. elegans und humane Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten übertragen mittels CRISPR/Cas9 Gen-Editierung. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur, grundlegende biologische Fragestellungen zu untersuchen, sondern soll auch neuartige optogenetischen Plattform zur Testung RyR-spezifischer Arzneimittel ermöglichen. Ziel 2 erweitert das OptoRyR2 Konzept durch einen neuen Ansatz direkter opto-mechanischer Kontrolle von RyR2-Kanälen. Hierzu werden Licht-sensitive und bewegliche LOV-Domänen in die RyR-Kanalstruktur eingefügt, was erstmals durch neuere hochauflösende CryoEM-Strukturen natürlicher RyR-Kanäle möglich ist. Ziel 3 schließt den Kreis durch die Entwicklung optogenetischer Werkzeuge zur gezielten Steuerung der ER/SR Ca2+-Aufnahme durch licht-gesteuerte hoch-lokalisierte cAMP-Produktion sowie durch direkte opto-mechanische Steuerung der SERCA.Zusammenfassend sollen optogenetische Werkzeuge zur dualen Kontrolle von Ca2+-Freisetzung und Aufnahme entwickelt werden, und als System-Plattform die gezielte Testung RyR-stabilisierender Substanzen ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1926: Next Generation Optogenetics: Tool Development and Application