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Projekt
Konstruktion von genetisch kodierten Licht-aktivierten K+ -Kanälen mit schnellem Gating und definierter zellulärer Sortierung
Antragsteller
Professor Dr. Gerhard Thiel
Fachliche Zuordnung
Biophysik
Förderung
Förderung von 2016 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 315030691
In vielen optogenetischen Anwendungen ist es notwendig, die Membran von Zellen zu hyperpolarisieren, um damit zum Beispiel das Feuern von Neuronen zu beenden. Gegenwärtig wird dies vor allem durch Opsin-basierte Pumpen oder Licht-empfindliche Anionenkanäle erreicht. Die genannten Proteine haben aber gewisse Nachteile. Die Anwendung der Anionenkanäle ist auf bestimmten Typen von Neuronen beschränkt; die Pumpen generieren anormale und ungewollte Ionengradienten. Da in Zellen die Hyperpolarisation der Plasmamembran üblicherweise durch die Aktivität von K+-Kanälen erreicht wird besteht daher eine große Nachfrage nach Licht-empfindlichen K+-Kanälen für optogenetische Anwendungen. Ideale Kanäle für diesen Zweck sollten vollständig genetisch kodiert sein, eine hohe K+-Selektivität aufweisen, eine hohe Einzelkanalleit-fähigkeit haben und sehr rasch und reversibel auf Dunkel/Licht-Änderungen reagieren; ferner sollten sie effizient zur Plasmamembran oder einer anderen definierten Zielmembran sortiert werden. Ziel dieses Projektes ist es daher, mittels Proteinengineering genetisch kodierte, Licht-empfindliche K+-Kanäle zu produzieren, die für eine breite und robuste optogenetische Anwendung tauglich sind. Das Projekt baut auf einem Prototyp von Licht-empfindlichen K+-Kanälen auf, den wir durch die Fusion der LOV2 Domäne aus dem Blaulichtsensor von Hafer mit einem kleinen viralen K+-Kanal gewonnen haben. In einem Teilprojekt werden wir die Expression des Kanals und seine Sortierung zur Plasmamembran (und gegebenenfalls in die Mitochondrien) verbessern und für Neuronen optimieren. Das soll erreicht werden, indem effiziente Sortierungssignale an das Protein angehängt werden oder indem eigene Sortierungssignale optimiert werden. Ferner sollen Methoden der directed evolution genutzt werden, um Expression und Sortierung des Kanals zu verbessern. Da unser Prototyp an Licht-empfindlichem Kanal nur sehr langsam auf Licht reagiert wird ein zweites Teilprojekt versuchen, die Reaktionszeit des Kanals auf Dunkel/Lichtänderungen zu beschleunigen. Dies soll durch ein fundamental anderes Design des Licht-gesteuerten Kanals erreicht werden. Dazu soll die vermeintlich langsame LOV Domäne entweder durch die kleine miniSOG Domäne oder durch sensorische Rhodopsine ersetzt werden. In dem Konstrukt mit miniSOG soll blaues Licht eine rasche Produktion von Sauerstoffradikalen erzeugen, die dann einen redox-sensitiven Kanal aktivieren. In dem alternativen Design sollte die lichtinduzierte Konformationsänderung in dem sensorischen Rhodopsin mechanisch auf das Gate des Kanals übertragen werden. Die funktionellen Eigenschaften von vielversprechenden Kanalkandidaten werden elektro-physiologisch charakterisiert; die besten Konstrukte werden an Kollegen im Schwerpunkt für in vivo Tests weitergegeben.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
