Chemische Sonden zur Analyse der Pyridoxal Phosphorylierung und funktionelle Charakterisierung als Enzymkofaktor in Krankheitsprozessen

• Antragsteller: Professor Dr. Stephan A. Sieber
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314976069

Pyridoxalphosphat (PLP) ist ein essentieller Kofaktor für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in prokaryotischen und eukaryotischen Organismen. Die PLP-katalysierten Reaktionen umfassen wichtige Prozesse wie Transaminierung, Decarboxylierung und Razemisierung, die alle wichtig für die Entstehung und Behandlung von Erkrankungen sind. PLP wird biosynthetisch von Pyridoxalkinasen durch Phosphorylierung von Pyridoxal (PL) hergestellt. Diese Enzyme benutzen einen konservierten, basischen Rest (oftmals Cystein) in ihrem aktiven Zentrum, der den nukleophilen Angriff der 5´-Hydroxygruppe auf das gamma-phosphat des ATPs unterstützt. In einer kürzlich erfolgten Studie haben wir eine neue Untergruppe dieser Enzymklasse identifiziert, die einen zusätzlichen nukleophilen Cysteinrest in einem flexiblen Proteindeckel dazu nutzt, ein Hemithioacetal mit dem 4´-Aldehyd des PL auszubilden und damit die Phosphorylierung voranzutreiben. Eine anschließende Analyse mehrerer bakterieller Genome hat ergeben, dass diese neue Unterklasse von dualen Cystein PLKs (CC-PLKs) stark verbreitet ist. Zusätzlich kann die Position des nukleophilen Cysteins im Deckel sehr stark variieren, so dass eine Eingruppierung in einzelne Klassen basierend allein auf der Sequenz sehr schwierig ist. Wir stellen deshalb eine chemisch-proteomische Strategie zum Design von elektrophilen PL-basierten Inhibitoren vor mit deren Hilfe mögliche Cysteinreste, die für die Bildung des Hemithioacetals verantwortlich sind, markiert werden können. Diese Inhibitoren werden zusätzlich mit einem Marker ausgestattet, der die proteomweite Aufklärung von CC-PLKs ermöglicht. Wir erwarten zusätzlich zu der Entdeckung neuer CC-PLKs weitere Proteine, die ebenfalls ein Cystein zur Hemithioacetalbildung verwenden. Deren mechanistische und funktionale Charakterisierung ist ein wichtiges Ziel dieses Antrags. Des weiteren möchten wir funktionalisierte PL Sonden verwenden um diese als trojanisches Pferd in PLP-abhängige Enzyme anstatt des nativen Kofaktors einzuschleusen. Die Sonden werden von den Zellen aufgenommen, phosphoryliert und dann in den aktiven Zentren über ein Aldimin kovalent gebunden. In unserem Ansatz wird diese labile Aldimin Bindung in eine stabile Verknüpfung überführt und anschließend in massenspektrometrischen Experimenten mit quantitativen Methoden untersucht. Das Hauptaugenmerk dieser Untersuchungen wird auf pathogenen Bakterien liegen, da CC-PLKs und PLP-abhängige Enzyme wichtige antibiotische Angriffsziele darstellen. Unsere funktionalisierten Moleküle werden daher nicht nur Einsatz als neuartige Inhibitoren finden, sondern stellen auch Werkzeuge für die Identifikation neuer Ziele in resistenten Keimen dar.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen