Sauerstoff abhängige Regulation einer Diguanylate Zyklase ohne kanonische sensorische und regulatorische Domänen in Pseudomonas aeruginosa

• Antragstellerin: Dr. Sandra Schwarz
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Parasitologie und Biologie der Erreger tropischer Infektionskrankheiten
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314744378

Diguanylate Cyclasen DGC, die keine sensorischen und regulatorischen Domänen aufweisen, sind weit verbreitet und in allen Klassen der Proteobakterien vorhanden. Die Mechanismen, die ihrer Regulation zugrunde liegen, sind jedoch unklar. Um unser Verständnis über die Grundsätze der cdiGMP Signalisierung voranzutreiben, ist es wichtig zu analysieren, wie die Aktivität dieser DGCs gesteuert wird. Wir haben in vorherigen Arbeiten gezeigt, dass die Membran gebundene DGC SadC die Alginatproduktion in Pseudomonas aeruginosa unter anaeroben Bedingungen stimuliert, und dass die Aktivität der gereinigten GGEEF Domäne von SadC exprimiert unter anaeroben deutlich höher ist, verglichen mit aeroben Bedingungen, die kaum nachweisbare Mengen an cdiGMP führen. Während SadC keinerlei kanonische sensorische und regulatorische Domänen enthalten, bildet das Protein ein regulatorisches Modul mit einem vorhergesagten Hydratase und Dioxygenase Reduktase, die als positiver und negativer Regulator der Alginat-Synthese wirken. In vitro Enzymassays zeigen, dass die Dioxygenase-Reduktase nicht aber die Hydratase die DGC Aktivität von SadC hemmt. Das Ziel dieser Studie ist es, die Modifikationen von SadC in P. aeruginosa in Reaktion auf Sauerstoff und Anoxie zu identifizieren. Zu diesem Zweck wollen wir die subzelluläre Lokalisation und das Interaktionsnetzwerk der drei Proteine unter aeroben und anaeroben Bedingungen unter Verwendung von Immun und time lapse-Fluoreszenzmikroskopie sowie in vivo cross linking Methoden bestimmen. Darüber hinaus wollen wir die Regionen von SadC, die an der sauerstoffabhängigen Regulation beteiligt sind identifizieren und diese Domänen dann eingehender mittels LC MS für die Detektion kovalenter Modifikationen analysieren. Bei letzterem werden die Bakterien auch in Gegenwart von stabil markierten 18O angezüchtet, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass molekularer Sauerstoff in SadC eingebracht wird, um dessen DGC Aktivität zu steuern.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1879: Nucleotide Second Messenger Signaling in Bacteria