Identifizierung und Quantifizierung niedermolekularer bakterieller Signalmoleküle mittels HPLC-gekoppelter Massenspektrometrie einschließlich der Ionenmobilitätstechnologie

• Antragsteller: Professor Dr. Roland Seifert, seit 7/2019
• Fachliche Zuordnung: Medizinische Mikrobiologie und Mykologie, Hygiene, Molekulare Infektionsbiologie ; Analytische Chemie
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314721994

In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl niedermolekularer bakterieller Signalmoleküle, entweder intrazellulär vorhanden oder sezerniert, beschrieben. Innerhalb dieser Gruppe von Metaboliten spielen sowohl lineare als auch zyklische Nukleotide eine entscheidende Rolle als second messenger in der Regulation wichtiger bakterieller Funktionen. Dazu gehören Guanosin-3´-diphosphat-5´-triphosphat (pppGpp), Guanosin-3´,5´-bispyrophosphat (ppGpp), 3´,5´-zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), 3´,5´-zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP), zyklisches dimeres Guanosin-3´,5´-monophosphat (c-di-GMP), zyklisches dimeres Adenosin-3´,5´-monophosphat (c-di-AMP), sowie zyklisches 3´,5´-Guanosinmonophosphat-3´,5´-Adenosinmonophosphat (3´,3´-cGAMP). Aufgrund ihrer geringen physiologischen Konzentrationen und ihres schnellen Metabolismus´ stellt die Identifizierung und Quantifizierung dieser Metaboliten hohe analytische Anforderungen. Wir haben sensitive und spezifische Nachweismethoden mittels HPLC-gekoppelter Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit dem hauptsächlichen Fokus auf die eindeutige Quantifizierung linearer und zyklischer Nukleotide und zyklischer Dinukleotide sowie deren Abbauprodukte entwickelt. Dabei sollten die etablierten LC-MS/MS Methoden Isotopen-markierte interne Standards einschließen, sowie die Analyse spezifischer Massenübergänge (quantifier und mehrere qualifier) umfassen. Eine besondere Aufmerksamkeit sollte auf die primären Schritte der Probenvorbereitung, auf die Robustheit der verwendeten HPLC-Methoden, sowie verlässliche MS/MS Konditionen entfallen. Die von uns etablierten Methoden können für die Analyse weiterer Substanzen wie beispielsweise chemisch modifizierte Nukleotide adaptiert werden. Es ist vorgesehen, in diesem Projekt weitere Optimierungen der bereits etablierten LC-MS/MS Methoden vorzunehmen. Hierbei soll die Probenextraktion weiter verbessert und spezielle Extraktionsverfahren für sezernierte Signalmoleküle aus dem zellulären Überstand entwickelt werden. Die biologische Synthese Isotopen-markierter interner Standards unter Verwendung rekombinanter Enzyme wird ein wichtiges Teilprojekt sein. Unsere Expertise in der LC-MS/MS Technologie soll allen wissenschaftlichen Partnern im SPP 1879 als Z-Einheit zur Verfügung stehen. Dabei wird die Identifizierung und Quantifizierung bekannter bakterieller Signalmoleküle im Mittelpunkt stehen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1879: Nucleotide Second Messenger Signaling in Bacteria
• Mitverantwortlich(e): Dr. Heike Bähre
• Ehemaliger Antragsteller: Professor Dr. Volkhard Kaever, bis 7/2019