Mechanismus der ATP-abhängigen DNA Superspiralisierung, Relaxierung und Decatenierung durch Typ IIA Topoisomerasen

• Antragstellerin: Professorin Dr. Dagmar Klostermeier
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314698507

DNA-Topoisomerasen regulieren den Superspiralisierungsgrad von DNA. Topoisomerasen vom Typ IIA spalten dazu beide Stränge einer DNA-Duplex mittels zweier katalytischer Tyrosine, und katalysieren den Durchtritt eines zweiten DNA-Segments durch die entstandene Lücke (Strangdurchtritt). Typ IIA-Topoisomerasen haben eine gemeinsame, zweifach symmetrische Kern-Struktur mit drei Kontaktflächen, dem N-Tor, DNA-Tor und C-Tor, deren koordiniertes Öffnen und Schließen den Strangdurchtritt ermöglicht. Trotz ähnlicher Strukturen katalysieren die einzelnen Vertreter verschiedene Reaktionen: ATP-abhängige negative Superspiralisierung (Gyrase), Relaxierung (Topo II) und Dekatenierung (Topo IV). In Einzelmolekül-FRET-Experimenten mit Gyrase haben wir gezeigt, dass die ATP-abhängige negative Superspiralisierung mit einer Kaskade von DNA- und ATP-induzierten Konformationsänderungen verbunden ist. Den Strangdurchtritt selbst haben wir bisher nicht experimentell beobachten können. Gyrase mit nur einem katalytischen Tyrosin kann ohne Strangdurchtritt, durch Einzelstrangspaltung und –wiederverknüpfung, superspiralisieren. Die ATP-abhängige Relaxierung und Dekatenierung erfordern hingegen zwei Tyrosine und Strangdurchtritt. Topo II und Topo IV können DNA in vitro relaxieren oder dekatenieren DNA in vitro, wohingegen Gyrase DNA superspiralisiert und dekateniert. In Bakterien vermittelt Topo IV die Dekatenierung von Replikationsintermediaten, Gyrase die Entfernung positiver superhelikaler Windungen vor der Replikationsgabel. Manche Bakterien besitzen nur ein einziges Typ IIA-Enzym, das beide Reaktionen übernehmen muss. Spezies-spezifische Insertionen in das strukturelle Gerüst modulieren die enzymatischen Aktivitäten von Gyrasen, und könnten die Balance zwischen beiden Reaktionen steuern.Um das mechanistische Spektrum von Typ IIA Topoisomerasen umfassend zu verstehen, werden wir die Mechanismen der ATP-abhängigen Superspiralisierung und Dekatenierung durch Gyrasen sowie der ATP-abhängigen Superspiralisierung und Dekatenierung durch Topo II und Topo IV untersuchen. Insbesondere werden wir DNA- und ATP-abhängige Konformationsänderungen dieser Enzyme während der verschiedenen Reaktionen und deren zeitliche Koordination in Einzelmolekül-FRET-Experimenten verfolgen. Wir werden die enzymatischen Eigenschaften ermitteln, die durch das gemeinsame strukturelle Gerüst der Gyrasen vermittelt werden, und die Rolle der Insertionen bei der Modulation dieser Aktivitäten und die Balance von Superspiralisierungs- und Dekatenierungsaktivität aufklären. Auf diesem Wege werden wir die mechanistischen Gemeinsamkeiten und Unterschiede in der Katalyse der verschiedenen Topoisomerase-Reaktionen durch Gyrase, Topo II und Topo IV identifizieren. Weiterhin werden wir die Balance zwischen zwei verschiedenen, durch das gleiche Enzym katalysierte Reaktionen, sowie Unterschiede und Gemeinsamkeiten im Mechanismus der gleichen, durch unterschiedliche Enzyme katalysierten Reaktion verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen