In vitro Reifungssystem für die Analyse der [NiFe]-Hydrogenase

• Antragsteller: Dr. Basem Soboh
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biophysik ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 314406875

Das Verständnis der Biogenese des katalytischen Kofaktors der [NiFe]-Hydrogenasen leistet einen wichtigen Beitrag zur Erzeugung von Biokatalysatoren mit hoher Effizienz im Umsatz von H2. Wir haben ein enzymatisches in vitro Reifungsystem entwickelt, das ausschließlich auf gereinigten Komponenten basiert und die Synthese funktioneller [NiFe]-Hydrogenasen ermöglicht. Der Reifungsprozess umfasst (i) die Biosynthese und den Einbau des prosthetischen Fe(CN)2(CO)-Teils, (ii) den Nickel-Einbau, (iii) die proteolytische Prozessierung des Pro-Proteins durch eine Hydrogenase-spezifische Endopeptidase und (iv) die abschließende Bildung einer aktiven Hydrogenase durch Dimerisierung der großen mit der kleinen Untereinheit. Mit diesem Reifungssystem können wir die vollständige Kofaktorsynthesemaschinerie in ihrem zeitlichen Ablauf kontrollieren. Die funktionelle Rolle der C-terminalen Verlängerung des Apo-Proteins während der Hydrogenase-Reifung wurde untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der C-terminus den Reifungsprozess steuert. Verschiedene Intermediate des Reifungsprozess konnten erfolgreich isoliert und charakterisiert werden. Darüber hinaus konnten wir einen supramolekularen Komplex bestehend aus fünf Reifungsproteinen und der großen Untereinheit der Hydrogenase 2 in vitro synthetisieren. Eines der Hauptziele des aktuellen Antrages ist es daher, die Struktur dieser hochinteressanten Momentaufnahme zu bestimmen und die Konformationsdynamik der [NiFe]-Reifungsmaschinerie mittels Kryoelelektronenmikroskopie (EM) aufzuklären. Das zweite Hauptziel dieses Antrags besteht darin, die schrittweise Synthese und Assemblierung des Hydrogenase-Cofaktors mittels Infrarotspektroskopie (ATR FTIR) zu verfolgen. Darüber hinaus wurden verschiedene Intermediate des Reifungsprozess isoliert und röntgenspektroskopische Untersuchung eingeleitet (EXAFS). Wir konnten die erste schlüssige Infrarot Charakterisierung der in vitro rekonstituierten „O2-sensitiven“ [NiFe]-Hydrogenase 2 durchführen. Mit unserem kürzlich entwickelten in vitro Reifungssystem für die „O2-tolerante“ [NiFe]-Hydrogenase 1 wollen wir die beiden Enzymen in Bezug auf die O2- und CO-Hemmung vergleichen. Die Untersuchung von „O2-toleranten“ und „O2-sensitiven“ [NiFe]-Hydrogenasen aus demselben Organismus wird einen direkten Vergleich erleichtern und kann wertvolle Inspiration für das Design von O2-toleranten Katalysatoren sein. Ein Enzymkomplex besteht aus einer CO-Dehydrogenase und einer membranständigen [NiFe]-Hydrogenase wurde vom Antragsteller isoliert und biochemisch charakterisiert. Der Enzymkomplex katalysierte die Umsetzung von CO und H2O zu CO2 und H2. Unser Ziel ist es, die Struktur des Proteinkomplexes durch Kryo-EM zu bestimmen. Die Protonierung-/ Reduktionsdynamik des Enzymkomplexes in der Umwandlung von CO in CO2 wird mittels in situ ATR FTIR verfolgt. Proteinfilmelektrochemie wird angewendet, um die Aktivität des Enzymkomplexes durch Aufzeichnung der katalytischen Ströme zu untersuchen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1927: Iron-Sulfur for Life