ROSA26-Cas9 transgene Schweine: eine Methode für das in vivo Genome Editing

• Antragstellerin: Tatiana Flisikowska, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Tierzucht, Tierernährung, Tierhaltung
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 311035631

Wir modellieren Tumorerkrankungen im Schwein, um die Entwicklung neuer Diagnostik- und Behandlungsmethoden zu unterstützen. Die Geninaktivierung beim Nutztieren wurde durch das CRISPR/Cas9 Gene-Editing drastisch vereinfacht. Eine vielversprechende neue Strategie sind CAS9 transgene Mäuse, bei denen zur Inaktivierung von Zielgenen in definierten Geweben nur noch die Guide RNA(s) eingebracht wird. Dieses somatische Zell-Engineering hat multiple Anwendungen, inklusive der Nachahmung von spontanen Mutationen, die für bestimmte Krebsarten verantwortlich sind. Diese Technologie soll nun auf das Schwein übertragen werden, um Möglichkeiten der Krebs Modellierung erheblich verbessern. Eine größere Zahl an Genen könnte simultan untersucht werden. Wobei die Anzahl an Versuchstieren verringert wird, entsprechend dem 3R Prinzip (replacement, reduction and refinement).Das Projekt nutzt dabei bereits vorhandene genetisch modifiziert Schweinelinien. Nach der Identifizierung des porcinen ROSA26 Lokus platzierten wir dort ein ubiquitär expremiertes, fluoreszierendes Reporterkonstrukt für die Visualisierung der Cre-Aktivität. Zusätzlich haben wir gene-targeted Schweine generiert mit Mutationen in Tumor relevanten Schlüsselgenen, wie die APC1311 Mutation (ortholog zum humanen APC1309), welche kolorektale Polyposis initiiert, und eine Cre-induzierbare Form vom onkogenem KRASG12D, ein wichtiger Treiber des Kolon- und anderer Karzinome. Wir werden konstitutiven und Cre-indzierbaren Cas9 Transgene via Gene-Targeting in den ROSA26 Lokus einbringen und Tiere mittels Kerntransfer generieren. Die dazu verwendeten Zellen tragen die APC1311 Mutation, so dass Gründertiere Polypen entwickeln werden. In diese können Guide-RNAs für Tumor relevante Gene endoskopisch eingebracht und dadurch inaktiviert werden. Nachfolgende Kolonoskopien werden den Phänotyp monitoren und Proben für molekulare und immunhistologische Analysen werden gesammelt. Die beste Methode für den in vivo Transfer von Nukleinsäuren in die Polypen (Elektroporation, AAV Vektor) wird parallel zur Generierung der Gründertier etabliert. Dazu soll Cre in Polypen von APC1311/Dual-Reporter Tieren eingebracht werden. Zur Effizienzbestimmung dient die Anzahl an Cre-rekombiniert Zellen, die mittels Fluoreszenzmikroskopie von Biopsieproben ermittelt wurde. Wenn es die Zeit erlaubt, werden wir lokale und Zelltyp-spezifische Aktivierung des Cre-induzierbaren Cas9 in vivo testen. Dazu könnte Cre vom Darmepithelium- spezifischen VIL1 (villin) Promoter expremiert werden. Wenn erfolgreich, dann ist geplant, das Cre-induzierbare Cas9 mit KRASG12D zu kombinieren, um die Effekte von onkogenem KRAS in Kombination mit der Inaktivierung von Tumorgenen zu untersuchen. Um wichtige Signalwege zu analysieren würden KRAS Effektorgene selektiv inaktiviert. Dieses Cas9 Schwein wird eine nützliche Ressource für Forscher in den unterschiedlichsten Bereichen sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Professorin Dr. Angelika Schnieke