Die Bedeutung sensorischer circumventrikulärer Organe als Eingangspforte inflammatorischer Signale in das Zentralnervensystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Mikrobielle Infektionen lösen im infizierten Säugerorganismus neben systemischen Reaktionen (Akute-Phase Antwort) auch zentralnervös kontrollierte Krankheitssymptome wie Fieber, Anorexie, HHA-Achsen Aktivierung und reduziertes Sozialverhalten aus. Dieses als „sickness behaviour“ bezeichnete Symptom kann durch die Interaktion exogener (molekulare Bestandteile pathogener, mikrobieller Organismen = PAMPs) oder endogener (proinflammatorische Zytokine) Faktoren mit dem Zentralnervensystem (ZNS) hervorgerufen werden. Zirkulierende PAMPs wie Lipopolysaccharid (LPS) bzw. proinflammatorische Zytokine können im Bereich sensorischer circumventrikulärer Organe (sCVOs) des Hypothalamus sowie der Medulla oblongata bei fehlender endothelialer Blut-Hirn Schranke (BHS) als afferente Signale durch die Bindung an entsprechende Rezeptoren (Toll-like Rezeptoren für PAMPs oder Zytokin-Rezeptoren) direkt mit spezifischen Zellen des ZNS kommunizieren. Ziel des geplanten Projekts war es, eine Beteiligung der sCVOs Organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) und Area postrema (AP) an der zentralnervös vermittelten Immunantwort auf periphere/lokale Immunsignale hinsichtlich beteiligter Signaltransduktionsprozesse auf zellulärer Ebene (Neurone und Gliazellen) für beide CVOs in vitro zu untersuchen. Dazu wurden zunächst Mikro-Primärkulturen beider sCVOs aus den Gehirnen neonataler, 3 - 6 Tage alter Rattenbabies etabliert, welche in serumfreiem Neurobasalmedium, supplementiert mit 2 % B-27, nach 4 - 6 Tagen aus einer Mischpopulation differenzierter Neurone, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikrogliazellen bestanden. Die zelluläre Stimulation durch verschiedene PAMPs (LPS, Muramyldipeptid = MDP, Lipopeptid = FSL-1) und proinflammatorische Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) wurde durch die mikrospektrofluorimetrische Analyse der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) erfasst, Expression und Freisetzung der Zytokine immuncytochemisch und mittels colorimetrischer Bioassays. Das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien führte in der AP-Primärkultur bei 4 %, in der OVLT-Primärkultur sogar bei 17 % aller untersuchten Neurone zu einer transienten Zunahme der [Ca2+]i, während sich TLR-2 spezifische PAMPs Grampositiver Bakterien bzw. von Mycoplasmen als ineffektiv erwiesen. In Bezug auf die Mikrogliazellen der beiden Primärkulturen sensorischer CVOs ergab sich eine signifikante Aktivierung bei 4 % der ED-1 immunpositiven Zellen der OVLT- und nahezu 10 % der AP-Kultur. Neben der Induktion intrazellulärer Calciumsignale bewirkte LPS bei beiden Primärkultur-Systemen auch die vermehrte Expression und Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α, sowie eine Induktion der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS), exklusiv in/aus Mikrogliazellen, nicht jedoch Neuronen oder Zellen der Neuroglia. Dabei zeigte das Antwortverhalten LPS-responsiver Zellen eine ausgeprägte Desensibilisierungs-Charakteristik sowohl hinsichtlich der Calciumsignale in Neuronen und Mikrogliazellen, als auch der Zytokin-Freisetzung aus Mikrogliazellen auf, welche der in vivo beschriebenen Endotoxin-Toleranz auf zellulärer Basis entsprechen könnte. Die in vivo Situation aus der Blutzirkulation in den Bereich der sCVOs übertretender bzw. endogen in den sCVOs freigesetzter proinflammatorischer Zytokine nachahmend, führte die Superfusions-Stimulation primärer Zellkulturen der AP respektive des OVLT mit TNF-α, IL-1β sowie IL-6 ebenfalls zu differenzierten Aktivierungsmustern von Neuronen, Astrozyten sowie Mikrogliazellen. Bei fehlender kapillarer Endothelbarriere und somit BHS könnten zirkulierende PAMPs und/oder proinflammatorische Zytokine u.a. Neurone und Mikrogliazellen im Bereich der sCVOs aktivieren. Nachgeschaltete efferente neuronale Signale zu assoziierten Kerngebieten des Hypothalamus würden dann zu einer Induktion des „sickness behaviour“ führen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2007). LPS- and FLS-1-induced calcium signals in primary cultures of rat sensory circumventricular organs. 2nd International Meeting on Physiology & Pharmacology of Temperature Regulation, Phoenix, Arizona, USA : S111
Rafalzik, S., Hild, D., Roth, J., Hübschle, T., Gerstberger, R.
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(2008) Rat area postrema microglial cells act as sensors for the toll-like receptor-4 agonist lipopolysaccharide. Journal of Neuroimmunology 204: 66-74
Wuchert, F., Ott, D., Murgott, J., Rafalzik, S., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2008). LPS, MDP and FSL-1 induced cellular activation in rat area postrema microglial cells. Leipziger Blaue Hefte 4 : 95
Wuchert, F., Ott, D., Murgott, J., Rafalzik, S., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2009) LPS-induced cellular activation of rat area postrema microglial cells. 3rd International Meeting on Physiology & Pharmacology of Temperature Regulation, Matsue, Japan : S161
Gerstberger, R., Wuchert, F., Ott, D., Murgott, J., Rafalzik, S., Roth, J.
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(2009) Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta and nitric oxide induce calcium transients in distinct populations of cells cultured from the area postrema. Journal of Neuroimmunology 206: 44-51
Wuchert, F., Ott, D., Rafalzik, S., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2009). LPS, MDP and FSL-1 induced cellular activation in rat area postrema microglial cells. Acta Physiol. 195 (Suppl.): 129
Wuchert, F., Ott, D., Murgott, J., Rafalzik, S., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2009). The organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) as a central nervous sensor for putative exogenous and endogenous pyrogens. Acta Physiol. 195 (Suppl.): 128
Ott, D., Rafalzik, S., Wuchert, F., Murgott, J., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2010). Neurons and glial cells of the rat organum vasculosum laminae terminalis act as direct central nervous sensors for lipopolysaccharide and pyrogenic cytokines. Brain Research 1363: 93-106
Ott, D., Murgott, J., Rafalzik, S., Wuchert, F., Schmalenbeck, B., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2010). PGE2 mediated calcium signaling in neuronal cells of the rat MnPO. Proceedings 19. Tagung der DVG-Fachgruppe Physiologie-Biochemie : p76. Verlag DVG Service, Giessen, ISBN-978-3-941703-55-1
Schmalenbeck, B., Ott, D., Hübschle, T., Roth J, Gerstberger, R.
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(2010). The organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) as a central nervous sensor for putative circulating pyrogens. Proceedings 19. Tagung der DVG-Fachgruppe Physiologie-Biochemie : p32. Verlag DVG Service, Giessen, ISBN-978-3-941703-55-1
Ott, D., Rafalzik, S., Wuchert, F., Murgott, J., Roth, J., Gerstberger, R.
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(2010). The rat organum vasculosum laminae terminalis acts as a direct central nervous sensor for LPS and pyrogenic cytokines. Brain, Behaviour and Immunity 24, Suppl. I; S1-S2
Roth, J., Ott, D., Rafalzik, S., Wuchert, F., Murgott, J., Gerstberger, R.
