Untersuchung des Einflusses der Kultivierungsparameter auf die N- und O-Glykosylierung rekombinanter Proteine in mikroverkapselten Insektenzellen
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war die Evaluierung eines Baculovirus-Expressionssystems in immobilisierten Insektenzellen zur Produktion glykosilierter pharmazeutischer Proteine humanen Ursprungs. Ein geeignetes Reaktorsystem wurde entwickelt und an die Paramerter Immobilisierung, Produktbildung und Expansion angepasst sowie für die kontinuierliche Produktion ausgelegt. In diesem System konnten dann Prozess- und Infektionsparametern analysiert werden, um verbesserte Expressionsraten zu erreichen. Die dafür erforderlichen Analysemethoden wurden etabliert und in der Praxis angewendet. Vor allem die online Sauerstoffmessung wurde durch ein Korrekturprogramm signifikant verbessert. Auf diesen Daten basierend wurde bei der Reaktorauslegung der besonders hohe Sauerstoffbedarf der Insektenzellen und deren Schersensitivität berücksichtigt, indem ein separates Begasungmodul für das Kulturmedium integriert wurde. Experimente zur Proteinproduktion wurden mit den Humanproteinen Erythropoietin (EPO) und Interleukin (IL-2, IL-4) durchgeführt, wobei sowohl die Anreicherung im Cytoplasma der Insektenzellen wie auch die Exkretion ins Medium berücksichtigt wurde. Es konnten detaillierte experimentelle Daten zu den relevanten Prozessgrößen TOI, MOI und TOH ermittelt werden. Der Zeitpunkt der Infektion einer Insektenzellkultur (TOI), die Menge der Viren im Inokulat (MOI) und der Zeitpunt der Proteinernte (TOH) sind für Produktionsen im vorgestellten Expressionssystem ausschlaggebend für die Ausbeute und somit für die Rentabilität des Prozesses. Um die entsprechenden Daten auch für verkapselte Insektenzellen ermitteln zu können, wurden Fusionskonstrukte der genannten Proteine mit dem fluoreszierenden Green Fluorescent Protein GFP eingesetzt, so dass infizierte Zellen mikrokopisch und photometrisch untersucht werden konnten. Es hat sich allerdings gezeigt, dass sich die Verkapselung für die Produktion zumindest der untersuchten Proteine nicht eignet. Bei beiden eingesetzten Humanproteinen sind wie bei vielen anderen Wirkproteinen ihre Glykosilierungen für ihren pharmazeutischen Einsatz von Bedeutung. In Bakterien findet eine Glykosilierung von Proteinen nicht statt, das Potenzial von Insektenzellen zur Glykosilierung wird aktuell kontrovers diskutiert. Nach der erfolgreichen Etablierung des Produktionsprozesses wurden deshalb rekombinante Musterglykoproteine hinsichtlich Glykosylierungsstellen, Glykosylierungstypen und -sequenzen mit MALDI-QIT-ToF-Massenspektroskopie charakterisiert. Dazu wurde zunächst die Vorgehensweise etabliert, Glykanstrukturen von Proteinen ausreichend detailliert zu untersuchen. Verschiedene enzymatische Degradierungsschritte. Deglykolisierungen und Proteolyse, wurden so aufeinander abgestimmt, dass sowohl die glykosilierten Aminosäuren in den jeweiligen Proteinen identifiziert werden konnten, als auch die Sequenz und Struktur der Glykanreste. Sowohl im rekombinanten humanen EPO (rhuEPO) als auch im rekombinanten humanen IL-4 aus Insektenzellen konnten die in den jeweiligen nativen Humanproteinen identifizierten Glykosilierungsstellen bestätigt werden. Für rhuEPO ergab sich für die drei Glykosilierungsstellen ein N-Acetylgalactosamin, das α-glykosidisch an den jeweiligen Asparaginrest gebunden ist, sowie eine an das N-Acetylgalactosamin β−(1,3)-glykosidisch gebundene Galaktose. rhuIL-4 ist einfach glykosiliert mit einem αglykosidisch gebundenen N-Acetylglucosaminrest. Diese Daten entsprechen den Erkenntnissen für native humane Proteine. Glykansequenzierungen ergaben für rhuEPO den pauci-mannosidischen Typ als vorherrschende Glykoform. Der Nachweis der Glykoformen F(6)1A2G(4)1S1, A2G(4)1S1, A2G(4)2, F(6)1A2G(4)1, A2G(4)1, und A2 in Insektenzellen bestätigt deren Potenzial, komplexe N-Glykosylierungsformen ausbilden zu können. In rhuIl-4 aus Insektenzellen wurden dreifach verzweigte, terminal sialylierte Glykane wie F(6)A3G(4)3S(6)3, A3G(4)3S(6)3, F(6)A3G(4)3S(6)2 und A3G(4)3S(6)1 gefunden.
Publications
- Baculovirus Expressionssystem im kontinuierlichen Prozess. Biotechnika (Life Science Spotlight), Hannover (2009)
Lindenberger C.
- MALDI-ToF-Massenspektrometrie – Strukturanalyse von Biomolekülen. Habilitationsschrift, Erlangen (2010)
Lange, H.
- Prozessabhängigkeit des Baculovirus-Expressionssystems. Erlangen (2010)
Lindenberger, C.
