Einzelmoleküluntersuchungen der eukaryotischen Transkriptionsinitiation
Biophysik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In dem Projekt Einzelmoleküluntersuchungen der Eukaryotischen Transkriptionsinitiation wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Jens Michaelis Messungen nach der Methode des Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfers (engl. Single-molecule FRET, smFRET) durchgeführt mit dem Ziel das mechanistische Verständnis der Transkriptionsinitiation in Eukaryoten zu verbessern. Zunächst musste die Frage beantwortet werden, in wieweit smFRET Experimente genutzt werden können um quantitative strukturelle Informationen zu erhalten. In einer großen international angelegten Studie konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse von smFRET Messungen bei genau definierter Messmethodik und -analyse sehr präzise FRET Ergebnisse liefern. Gleichzeitig konnte durch die Entwicklung von Farbstoffmodellen die experimentell bestimmten FRET Effizienzen auch in Distanzen umgerechnet werden, wobei die jeweiligen Modelle durch Konsistenztest im Rahmen dieses Projekts neu entwickelten Fast-NPS Verfahren überprüft werden können. Zur Anwendung der Methodik auf die eukaryotische Transkriptionsinitiation ist eine große Schwierigkeit die Anbringung von Farbstoffmolekülen an beliebiger Position. Hier konnte durch eine Kombination von Hefegenetik und Chemischer Biologie Verfahren entwickelt werden mit deren Hilfe Komplexe mit Farbstoffmarkierung an nahezu beliebiger Stelle hergestellt werden können. Angewandt auf die Fragestellung der Transkriptionsinitiation wurde der Mechanismus des Transkriptionsinitiationsfaktors TFIIF genauer untersucht und entscheidende Domänen und sogar Aminosäurereste für die Stabilisierung der DNA im aktiven Zentrum der Polymerase identifiziert. In Anbetracht des gleichzeitig stattfindenden sprunghaften Fortschrittes der Strukturbiologie durch Lösen der Strukturen von immer größeren Initiationskomplexen, wurde das Forschungsgebiet auf das Verständnis der Position und Dynamik von Nukleosomen bei der Transkriptionsinitiation erweitert. Mit Hilfe von smFRET wurde dabei die nukleotidabhängige Veränderung der Nukleosomenstruktur durch CHD1 untersucht, sowie die Funktion der Histonenschwänze bei der Positionierung von Nukleosomen mit dem Komplex Ino80 untersucht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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“Fast-NPS-A Markov Chain Monte Carlo-based analysis tool to obtain structural information from single-molecule FRET measurements “, Computer Physics Communications (2017), 219, 377-389
T. Eilert, M. Beckers, F. Drechsler, J. Michaelis
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“smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex”, Methods (2017), 120, 115-124
N. Malkusch, T. Dörfler, J. Nagy, T. Eilert, J. Michaelis
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“Structural information from singlemolecule FRET experiments using the Fast-Nano-Positioning System.” Journal of Visualised Experiments, (2017), 120, e54782
T. Dörfler, T. Eilert, C. Röcker, J. Nagy and J. Michaelis
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“Structural reorganization of the chromatin remodeling enzyme Chd1 upon engagement with nucleosomes”, Elife (2017), 6, e22510
R. Sundaramoorthy, A. L. Hughes, V. Singh, N. Wiechens, D. P. Ryan, H. El-Mkami, M. Petoukhov, D. I. Svergun, B.Treutlein, S. Quack, M. Fischer, J. Michaelis, B. Boettcher, D. G. Norman, T. Owen-Hughes
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“Complete Kinetic Theory of FRET”, Journal of Physical Chemistry B (2018), 122, 11677-11694
T. Eilert, E. Kallis., J. Nagy, C. Röcker, J. Michaelis
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“Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements – a worldwide benchmark study, Nature Methods”, Nature Methods (2018), 15, 669-676
B. Hellenkamp, S. Schmid, J. Michaelis, C. Seidel, T. Craggs, T. Hugel
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“Precison and Accuracy in smFRET based structural studies – a benchmark study of the Fast-Nano-Positioning System”, Journal of Chemical Physics (2018), 148, 123308
J. Nagy, T. Eilert and J. Michaelis
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“Single molecule nucleosome remodeling by INO80 and effects of histone tails“, FEBS Letters (2018), 529, 318-331
M. Schwarz, K. Schall, E. Kallis, S. Eustermann, M. Guariento, M. Moldt. K.P. Hopfner, J. Michaelis
