Funktionelle Charakterisierung des Trithoraxproteins Ash2l, einer Kernuntereinheit von Histone H3 Lysin 4 Methyltransferasekomplexen

• Antragsteller: Professor Dr. Bernhard Lüscher
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 281511112

Differenzielle Genexpression ist notwendig, um die Identität von Zellen und deren physiologische Funktionen zu definieren. Dabei spielt die Regulation des Chromatins eine wichtige Rolle, insbesondere das Remodeling von Nukleosomen und die Modifikation von Kernhistonen. Eine dieser Modifikationen ist die Methylierung von Histon H3 an Lysin 4. Dabei ist die Mono-Methylierung mit aktiven Enhancern und die Tri-Methylierung (H3K4me3) mit aktiven Promotoren und Genexpression assoziiert. Die Methylierung von H3K4 wird durch Enzyme der KMT2-Familie durchgeführt. Diese Enzyme, MLL1-4, SET1A und SET1B, benötigen einen Komplex aus WDR5, RBBP5, ASH2L und DPY30 (den sogenannten WRAD-Komplex), um katalytisch aktiv zu sein. Wir untersuchen ASH2L, da wir dieses Trithorax-Protein als Interaktionspartner des Proto-Onkoproteins c-MYC identifiziert haben. Wir haben gefunden, dass der Knockout von Ash2l sowohl in der Leber, als auch im hämatopoetischen System in der Maus letal ist. Diese Befunde sind durch eine reduzierte H3K4me3 und deregulierte Genexpression begleitet. Insgesamt weisen die Daten auf eine essentielle Funktion von H3K4 Methylierung hin. Es ist jedoch nicht klar, welche Funktion diese Modifikation für die Chromatinstruktur und die Genexpression hat. Deshalb verfolgen wir diese zwei Ziele: (i) Wir wollen mehr über die Funktionen von ASH2L erfahren und dessen Zusammenspiel mit KMT2-Komplexen verstehen. (ii) Wir wollen die Rolle der H3K4 Methylierung an Promotoren untersuchen. Dazu werden wir unsere Mäusembryofibroblasten mit gefloxten Ash2l-Allelen nutzen, die eine regulierbare Cre-Rekombinase exprimieren. In diesen knockout Fibroblasten werden wir mit einer Struktur-Funktionsanalyse relevante Bereiche von ASH2L mittels Komplementationsexperimenten definieren können. Dazu wird auch die H3K4-Methylierung und die Genexpression bestimmt. Zudem wollen wir neue Interaktionspartner von ASH2L mittels BioID identifizieren, indem wir eine Mutante nutzen, die an andere Untereinheiten des WRAD-Komplexes nicht binden kann. Da das Ausschalten von Ash2l ein insgesamt langsamer Prozess ist, werden wir die Mäusembryofibroblasten und menschliche Zelllinien generieren, die ein Ash2l Fusionsprotein mit einem Auxin-induzierbarem Degron exprimieren, um direkte Effekte durch einen Verlust von ASH2L messen zu können. Mit Hilfe von Nukleosomenmapping und ATAC-seq wollen wir außerdem mögliche Änderungen in der Chromatindichte bestimmen. Diese Versuche werden durch Analysen mit dCas9-Fusionsproteinen unterstützt, die die gezielte Lokalisierung von ASH2L und Mutanten, sowie von zusätzlichen epigenetischen Regulatoren, an Zielgene erlauben. Zudem sollen Signale, die eine direkte Genexpression induzieren können, bezüglich ihrer Sensitivität auf den Verlust von H3K4 Methylierung untersucht werden. Zusammen werden uns diese Untersuchungen neue Befunde zu den fundamentalen Funktionen von ASH2L liefern und die Rolle von H3K4 Methylierung in der Gentranskription weiter klären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen