Substraterkennung und Spezifitätsmodulierung von Cullin4-RING E3 Ubiquitinligase-Substratrezeptoren

• Antragsteller: Dr. David Schwefel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 280022178

Cullin4-RING Ubiquitinligasen evolvierten eine modulare Architektur, um gezielt Ubiquitin an zelluläre Proteine anzuknüpfen. Dadurch werden die Proteolyse durch das Proteasom oder andere regulatorische Prozesse eingeleitet, was insbesondere Bedeutung für DNA-Reparatur, DNA-Replikation und Zellyzklusregulation hat. Substratspezifität wird hierbei durch austauschbare Rezeptorproteine (DCAFs) sichergestellt, die über einen Adapter (DDB1) an den katalytischen Cullin4-RING-Subkomplex angebunden sind. Kenntnisse der molekularen Determinanten für die Anbindung des Rezeptors an den katalytischen Kern, sowie für die Erkennung spezifischer Sequenzen im Substratprotein durch den Rezeptor sind entscheidend für das Verständnis des gezielten Ubiquitinligations-Mechanismus und für die Erforschung zellulärer Auswirkungen.Im ersten Teil des vorliegenden Projektantrags sollen Einblicke in die endogene Funktion des DCAF1-Rezeptors erlangt werden. DCAF1 ist essentiell für die Regulation der DNA-Replikation und Methyltransferase-abhängiger Gentranskription. Durch eine Kombination von in vitro-Methoden und zellbasierten Versuchen werden die individuellen funktionellen Domänen von DCAF1 identifiziert und deren Interaktionen mit DDB1 und Substraten beschrieben. Dies wird klären, wie DCAF1 in den E3-Ligasekomplex integriert ist, wie spezifische Erkennung von methylierten und anderen Substratsequenzen die Substratdegradation induzieren, und zu welchen zellulären Konsequenzen dies führt.Das Cullin4-RING-System wird in virusinfizierten Zellen auch durch virale Faktoren beeinflusst. Hierbei binden sogenannte virale akzessorische Proteine an DCAF1, verändern dessen molekulare Oberfläche und lenken dadurch die Spezifität des Systems auf intrazelluläre antivirale Faktoren um, um bessere Bedingungen für die Virusreplikation zu erzeugen. Im zweiten Teil des Projekts soll die Interaktion von DCAF1 mit dem akzessorischen Protein Vpr aus Immunodefizienzviren untersucht werden, um den Mechanismus der Vpr-induzierten DCAF1-Spezifitätsänderung und der daraus resultierenden Degradation antiviraler Proteine zu verstehen. Dieser Ansatz wird nicht nur mechanistische Erkentnisse über die virale Modifikation des Cullin4-RING-Systems liefern, sondern trägt auch weiter zum Verständnis retroviraler Replikation bei.Das Substratspektrum anderer DCAF-Rezeptoren ist, abgesehen von DCAF1, DCAF2 und DBB2, nur unzureichend beschrieben. Daher soll im dritten Teil des Projekts eine Expressions-Bibliothek von 13 weiteren humanen DCAF-Proteinen erstellt und deren DDB1-Interaktion sichergestellt werden. Pull-down Experimente in vitro und in vivo zusammen mit massenspektrometrischen Methoden werden durchgeführt, um spezifische DCAF-Substratkandidaten zu identifizieren. Diese Kandidaten werden in weiterführenden biochemischen, strukturellen und funktionalen Ansätzen verifiziert, um so neue Einblicke in die Cullin4-Rezeptorspezifität und damit in die Biologie des Cullin4-RING-Systems zu erlangen.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen