Strukturelle Untersuchungen an zwei chemisch getriebenen Na+-translozierenden Proteinkomplexen

• Antragstellerin: Dr. Stella Vitt
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277935450

Die Evolution brachte faszinierende -enzymatische Maschinen- hervor, die in der Lage sind, chemische Energie in einen elektrochemischen Ionengradienten umzuwandeln. Die am besten untersuchten Enzymkomplexe sind diejenigen der Atmungskette; jedoch besitzen Mikroorganismen eine Reihe weiterer Systeme mit analogen Fähigkeiten, aber mit gänzlich anderen Strukturen und chemischem Antrieben. Das beantragte Projekt umfasst die strukturelle und funktionale Untersuchung zweier solcher Membranproteinkomplexe, die beide Na+ durch die Zellmembran pumpen und Schlüsselenzyme bei der Energiekonservierung verschiedenster Gärstoffwechsel darstellen. Na+-translozierende Biotin-abhängige Dekarboxylasen (Na+-Bdc) katalysieren die exotherme Dekarboxylierung von (vinylogenen) beta-Ketosäuren wie Glutaconyl-CoA, die häufig als Metabolite in anaeroben Bakterien vorkommen. Die H+/Na+ -translozierende NAD+-Ferredoxin-Reduktase (Rnf) reduziert NAD+ mit Hilfe des energiereichen Ferredoxins, welches durch ein Flavin-basiertes Elektronenbifurkationssystem zur Verfügung gestellt wird. Zuerst plane ich die Glutaconyl-CoA-Dekarboxylase aus Acidoaminococcus fermentans und Rnf aus Clostridium tetanomorphum bis zur Homogenität zu reinigen und Einzelpartikel Cryo-Elektronenmikroskopische (EM) Analysen durchzuführen um Informationen über die Qualität der Gesamtkomplexe und eine gering aufgelöste Struktur zu erhalten. Parallel dazu werden die löslichen Untereinheiten beider Komplexen produziert für hochaufgelöste Strukturen, welche anschließend in die niedriger aufgelöste Elektronendichtekarte angepasst werden können. Nach weiterer Optimierung der Homogenität durch Variation des Detergenztyps und der Lipidmenge sollen Kristallisationsexperimente mit der -in surfo- und -in meso- Methode durchgeführt werden. Dieses Projekt ist anspruchsvoll aber sehr wichtig um die Funktionsweise der chemisch angetriebenen Na+-Pumpen aufzuklären. Zu einem späteren Zeitpunkt kann die heterologe/homologe Produktion von großer Bedeutung sein. Zusätzlich werde ich versuchen, eine Na+-translozierende Aktivität für das gereinigte Rnf aus C. tetanomorphum nachzuweisen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen