Einfluss einer schnellen Inaktivierung von Clathrin-Funktionen in einer Vertebratenzelllinie auf entscheidende zelluläre Prozesse
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Clathrin ist ein hoch konserviertes Protein und wichtig für den intrazellulären Vesikeltransport. Die Bedeutung von Clathrin-abhängigen und redundanten Funktionen untersuchte man bisher mit verschiedenen „Knock-down“-Methoden. In der Arbeitsgruppe von Dr. Antony Jackson wurde eine Zelllinie etabliert, mit der man Clathrin komplett ausschalten kann (Clathrin Knockout). Zusammen mit den „Knockdown“-Methoden hat aber auch diese Zelllinie den Nachteil, dass sich die Zellen bis zum Verschwinden des bis zu drei Tagen stabilen Clathrins adaptieren können, und so das Versuchsergebnis verfälscht wird. Um diese Fehlerquelle auszuschließen, wollte ich mit zwei unterschiedlichen Ansätzen chromosomale Clathrin-Mutanten erzeugen, die innerhalb von Minuten inaktivierbar sind: Hitze- und laserlichtinaktivierbares Clathrin. Ursprünglich habe ich meine beiden Ansätze, laserlicht-inaktivierbares und hitzeschock-inaktivierbares Clathrin, stabil zu exprimieren als erfolgreich eingestuft. Überraschenderweise hat sich aber herausgestellt, dass es erhebliche experimentelle Probleme mit dem laserlicht-inaktivierbarem Clathrin gab, so dass ich aus Zeitgründen dieses Projekt abgebrochen habe. Der Ansatz eine Zellline zu erzeugen, die ein temperatur-sensitives Clathrin stabil exprimiert, hat sich als erfolgreich erwiesen. Ich habe zunächst die Zellline bezüglich ihres temperatur-sensitiven Phänotyps charakterisiert, bevor ich zellbiologische Fragestellungen angegangen bin. Ich konnte zeigen, dass der plötzliche Verlust von Clathrin keine Reaktion in der Zelle auslöst, die darauf schließen lassen könnte, dass die Funktion von Clathrin zumindest teilweise von anderen Proteinen oder anderen intrazellulaeren Reaktionsketten übernommen wird. Ich habe auch Hinweise gefunden, dass es in der von mir verwendeten Zelllinie einen Clathrin-unabhängigen Weg vom Golgi-Apparat zu den Lysosomen gibt, und nicht, wie bisher allgemein für höhere Vertebraten angenommen, nur einen Clathrin-abhängigen. Vor allem diese letztgenannte Entdeckung dürfte neue Fragen bezüglich des intrazellulären Vesikeltransports aufwerfen. Meine Ergebnisse sowohl bezüglich der schnellen Clathrininaktivierung, als auch dem Werkzeug „temperatur-sensitives Clathrin“ als solches, können als Grundlage für Forschungsarbeiten dienen, die sich mit Clathrin-(un)abhängigen Prozessen befassen.
