Entwicklung von photo-reaktiven Sonden zum Einfangen von G-Quadruplex-DNA im Komplex mit endogenen Proteinen und exogenen Liganden

• Antragsteller: Professor Dr. Elmar Weinhold
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 258773983

G-Quadruplexe (G4) sind sekundäre Nukleinsäurestrukturen, die sich in Guanin-reichen DNA-Regionen ausbilden können und vermutlich wichtige regulatorische Aufgaben bei der DNA-Prozessierung übernehmen (Replikation, Transkription, Rekombination und Telomererhaltung). Im Einklang damit wurden einige G4-interagierende Proteine (G4-Proteine), die G4-Strukturen in vitro binden, stabilisieren oder auflösen können, und viele potentielle G4-bildende Sequenzen in Genomen gefunden. Kürzlich konnten sogar G4-Strukturen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern in Zellkernen von Säugetieren nachgewiesen werden. Unser Verständnis über die biologischen Funktionen von G4-DNA und interagierenden Proteinen ist aber dennoch sehr beschränkt.In diesem Projekt möchten wir alternative chemische Sonden zur Indentifizierung von G4-DNA-Strukturen und interagierenden Proteinen in zellulärer Umgebung entwickeln. Photo-Quervernetzung ist ein privilegierter Ansatz zur Untersuchung von Protein- und Wirkstoff-DNA-Wechselwirkungen und führt zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den interagierenden Partnern. Zwei Serien von trifunktionellen Fangverbindungen (Capture Compounds Lig-CC and G4-CC) mit 1) einem G4-spezifischen Kleinmolekülliganden (G4-Ligand, Lig) zum Binden und Stabilisieren von G4-Strukturen ODER einer bekannten G4-DNA als Köder zum Rekrutieren von G4-Proteinen (Selektivitätsfunktion), 2) einem photoaktivierbaren Quernetzer (Reaktivitätsfunktion) zur Stabilisierung der Wechselwirkung zur Beute (G4-DNA oder G4-Protein) durch kovalente Bindungsbildung und 3) einen Biotinrest (Sortierungsfunktion) zur Isolierung der quervernetzten Komplexe sollen synthetisiert werden. Diese molekularen Angelhaken werden zunächst mit strukturell gut definierter, synthetischer G4-DNA (C-myc, CEB1 und CEB25) oder bekannten, gereinigten G4-Proteinen (Nucleolin und Pif 1 Helikase) in vitro evaluiert. Durch diesen Schritt sollen die besten Fangverbindungen in bezug auf Spezifität und Ausbeute ausgewählt und effiziente Fangprotokolle erstellt werden. Die besten Lig-CC werden dann zum Einfangen von G4-DNA in lebenden Zellen und, parallel dazu, die besten G4-CC zum Herausfischen von unbekannten G4-Proteinen aus eukaryontischen Kernextrakten eingesetzt. Isolierte G4-DNA wird durch DNA-Sequenzierung und G4-Proteine nach Trypsin-Fragmentierung mit nanoLC-MS/MS identifiziert. Abschließend wird die biologische Relevanz der gefundenen Kandidaten in vivo validiert werden. Dazu sollen Hefestämme mit G4-DNA-Isertionen oder G4-Protein-Deletionen hergestellt und deren Genominstabilität untersucht werden.Mit diesem koordinierten Forschungsansatz möchten wir chemische Sonden zur Bestätigung und Lokalisation von G4-DNA in eukaryontischen Genomen sowie zur Identifizierung neuer G4-Proteine entwickeln. Diese Strategie könnte in Zukunft mit der gefundenen G4-DNA als Köder in analogen Fangexperimenten eingesetzt werden und wird zu einem besseren Verständnis der Biologie von G4-DNA führen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Beteiligte Personen: Dr. Alain Nicolas; Dr. Marie-Paule Teulade-Fichou