Systematische Identifizierung und Charakterisierung fehlender GEFs von GTPasen

• Antragsteller: Professor Dr. Roger S. Goody; Professor Dr. Aymelt Itzen
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2014 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 258576031

Das Ziel des Projekt ist die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden zur Identifikation und Charakterisierung von Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) der Familie der kleinen GTPasen. Obwohl eine große Anzahl von GEFs den entsprechenden GTPasen bereits zugeordnet werden konnten, fehlen diese in anderen Fällen. Im Fall der Rab Proteine ist für viele der 60 Familienmitglieder noch kein GEF bekannt, trotz der extensiven Studien vieler Jahre an diesen Proteinen (z.B. Rab6). Zwei hauptsächliche Ansätze werden hier vorgeschlagen: Erstens wird die GTP/GDP-Depletion von Zelllysaten verwendet um GEFs ausgewählter GTPasen an einer GTPase-beladenen Festphase zu immobilisieren, um durch Zugabe von GTP co-immobilisierte GEFs spezifisch zu eluieren. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht in der GTP-spezifischen Elution und der Möglichkeit, andere assoziierte Proteine der GEFs (welche oftmals Multidomänenproteine sind, die viele Protein-Protein-Inkteraktionen herausbilden) durch Massenspektrometrie identifizieren zu können. Zweitens werden modifizierte Guaninnukleotide kovalent an GTPase-Mutanten, die ein zusätzliches Cystein enthalten, gebunden werden, wodurch sie irreversibel in dem jeweiligen Nukleotidzustanden fixiert werden. Dieses umfasst die aktiven (GTP) und inaktiven (GTP) Zustände, ebenso wie die GMP und Guanosin Modifikationen. Die GMP und Guanosin Modifikationen repräsentieren dabei grundsätzlich den nukleotidfreien Zustand und interagieren dadurch hochaffin mit ihren GEFs in einer nukleotid-unabhängigen Weise. Diese Eigenschaft wird in GEF-Immobilisierungsexperimenten wiederum ausgenutzt werden, um gebundene Proteine mittels Massenspektrometrie identifizieren zu können. Neu-identifizierte GEFs und ihre Interaktionspartner werden im Folgenden intensiv in vitro (3-D Strukturbestimmung, Kinetiken) und in vivo (Zellbiologie, Mikroskopie) charakterisiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Beteiligte Person: Professor Dr. Bruno Goud