Zellsortierung und Spezifikation der Abstammung an der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Brand
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Entwicklungsneurobiologie ; Evolutionäre Zell- und Entwicklungsbiologie der Tiere ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 251970880

In der Embryonalentwicklung organisieren sich Zellen schrittweise und reproduzierbar zu Geweben und Organen, mit jeweils charakteristischer Zusammensetzung und Arrangement der Zellen. Dies erfolgt unter der Kontrolle von Organisator-Zentren, die über extrazelluläre Signale ihre Nachbarzellen instruieren. Die 'midbrain-hindbrain boundary' (MHB) enthält eine paradigmatische Organisator-Zellpopulation. Embryologische Arbeiten zeigen, dass die MHB Organisator-Zellpopulation selbst, sowie die umgebenden Zellen, räumlich geordnet sein müssen. Spezifisch stellt die MHB eine sog. 'lineage restriction boundary' dar, die eine Durchmischung von prospektiven Mittel- und Hinterhirnzellen verhindert; die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch unklar.Wir haben multiple Kombinationen CRISPR-basierter knock-in Reporter Linien hergestellt und verwendet für Gene, die an der MHB exprimiert sind, in Kombination mit Rasterkraftmikroskopie an Einzelzellen, sowie mit in vivo molekularen Force-Sensoren. Wir konnten zeigen, dass prospektive Mittelhirn und Hinterhirn Vorläuferzellen unterschiedliche Adhäsions- und Tensionseigenschaften aufweisen, bereits während früher embryonaler Stadien. Weiterhin fanden wir, dass die Störung von Eph-ephrin Signalprozessen zur Fehlsortierung von Zellen an der MHB führt. Diese Beobachtungen implizieren einen Beitrag des Eph-ephrin Signalwegs zu den molekularen Mechanismen, die zu differentieller Adhäsion und Tension führen. In diesem Projekt wollen wir nun ermitteln, ob die beobachteten Unterschiede in Adhäsion und Tension kausal verantwortlich sind für die zellulären Sortierung und Restriktion bei der Bildung und Aufrechterhaltung der Mittelhirn-Hinterhirn Grenze. Hierfür wollen wir (i) genetische und optogenetische Tools, in Kombination mit transgenen Reporterlinien und Cre-Rekombinase Linien, verwenden, um Aktomyosin und Komponenten des Cytoskeletts spezifisch in prospektiven Mittelhirn und Hinterhirnzellen zu inaktivieren, und die Folgen dieser Inaktivierung für die MHB zu visualisieren. Um (ii) den Charakter und das zelluläre Entwicklungspotential der Zellen an der Grenze selbst zu untersuchen, werden wir Zelltyp-spezifische Ablationen und live imaging verwenden, um Zellen mit früh überlappender Otx und Gbx Expression als Marker für Mittel- bzw. Hinterhirnprimordium zu untersuchen. Hierzu werden wir die Zellstammbäume dieser Zellen und der Organisator Zellen selbst, auf Einzelzellniveau verfolgen ('lineage tracing'). Schliesslich werden wir (iii) die Notwendigkeit von Eph-ephrin Signalen und ihre Rolle bei der Etablierung differentieller Adhäsion und Tension an der MHB untersuchen, mit Hilfe von Eph-ephrin Mutanten und pharmakologischen Blockern, in Kombination mit molekularen Force-Sensoren. Die Ergebnisse werden ein besseres Verständnis von geordneter Gewebebildung, Grenz- und Musterbildung ermöglichen, die mit solch wunderbarer Präzision in der Embryonalentwicklung ablaufen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen