Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit lokalisierungsbasierter Superauflösung
Final Report Abstract
Die meisten aktuell laufenden Projekte in meiner Arbeitsgruppe verwenden DNA-origamibasierte Nanostrukturen, die als molekulares Steckbrett dienen, um Farbstoffe und andere kleine Moleküle mit Nanometerpräzision in drei Dimensionen anzuordnen. Das beschaffte Superauflösungsmikroskop ist – neben dem Rasterkraftmikroskop – unser Standardinstrument geworden, um die Faltung sowohl von etablierten als auch neu designten DNA-Origamistrukturen mittels der von uns entwickelten Superauflösungsmethode DNA PAINT zu charakterisieren. Dazu werden Markierungen an verschiedenen, vorher genau determinierten Positionen des DNA Origamis eingeführt. Mittels Superauflösung können die Abstände der Markierungen in drei Dimensionen genau bestimmt werden, so dass auf die exakte Form der DNA Origamistruktur zurückgeschlossen werden kann. Da das beschaffte Mikroskop eine weitfeld-basierte Methode der Superauflösung bietet, werden auf diese Weise in einem einzigen Experiment eine sehr große Anzahl an Strukturen zeitgleich vermessen, so dass auch eine Einschätzung der Ausbeute an korrekt gefalteten Strukturen möglich ist. Da das Auflösungsvermögen von Superauflösungsmikroskopen stark von der unmittelbaren Umgebung des Farbstoffes und damit auch probenabhängig ist, hat meine Arbeitsgruppe Auflösungsstandards entwickelt, mit denen die erzielte Auflösung eindeutig charakterisiert werden kann. Diese Auflösungsstandards bestehen aus einem DNA Origamigerüst, auf welchem in genau definiertem Abstand einzelne Farbstoffe angeordnet sind. Abstand sowie Anzahl der Farbstoffe können je nach Anforderungen variiert werden, so dass das Auflösungsvermögen des Systems bestimmt werden kann. Im Rahmen einer EXIST-Förderung des BMWi ist basierend auf diesen Auflösungsstandards eine Ausgründung erfolgt: Die Firma GATTAquant ist mittlerweile ein Unternehmen mit 4 Mitarbeitern. Das Mikroskop wurde während der EXIST-Förderung dazu genutzt, die Standards in Bezug auf Robustheit und Zuverlässigkeit zu optimieren (Prototypenentwicklung), so dass sie für die kommerzielle Verwendung geeignet sind. Aktuelle wissenschaftliche Weiterentwicklungen auf diesem Gebiet, die in meiner Arbeitsgruppe durchgeführt wurden, sind zum Beispiel Experimente, die Auflösungsstandards auch in lebende Systeme einzuschleusen oder für die Expansionsmikroskopie zu nutzen. Über Kolokalisationsexperimente, welche die Mehrfarbenkapazität des Mikroskops ausnutzen, wird in diesen Fällen zuerst sichergestellt, dass die DNA Origami Nanolineale spezifisch und mit wenig Hintergrund gebunden sind. Anschließend wird die Superauflösungskapazität genutzt, um die Standards mittels dSTORM oder DNA PAINT aufzulösen. Durch eine Kooperation mit der PTB (physikalisch-technische Bundesanstalt) konnte auf diese Weise auch eine Rückführung der Größen auf SI-Einheiten erreicht werden. Damit kann man DNA Nanolineale jetzt durchaus als Standards bezeichnen. Die Emission von Farbstoffen ist nicht nur von lokalen Parametern wie dem Brechungsindex abhängig, sondern wird auch durch die Anwesenheit von metallischen Nanopartikeln beeinflusst. In meiner Arbeitsgruppe wird diese Methode eingesetzt, um Fluoreszenzsignale durch sogenannte plasmonische Antennen zu verstärken. Eine Anwendung ist die sensitive Diagnostik: Wir haben molekulare Erkennungsmechanismen entwickelt, welche in die Antenne integriert werden können, so dass Signale von einzelnen Target-Molekülen einfach nachgewiesen werden können. Dazu wurden mit dem Mikroskop eine Reihe von Kolokalisations- und Unquenching- Studien durchgeführt, welche die Spezifizität der molekularen Erkennung in der Nanoantenne gezeigt haben. Neben der Emissionsrate wird auch die Emissionsgeometrie durch einen Nanopartikel verändert: Wir konnten erstmalig zeigen, dass die räumliche Emission eines Fluorophores durch die Anwesenheit eines Nanopartikels beeinflusst wird. Dazu haben wir dreidimensionale Superauflösungsexperimente mit farbstoffmarkierten, rechteckigen DNA Origamis mit und ohne Nanopartikel, die die Emission beeinflussen, durchgeführt. Auf diese Weise konnten wir nachweisen, dass die Anwesenheit der Nanopartikel die Emission räumlich verschiebt - eine „Optische Täuschung mit einzelnen Molekülen“. Eine andere Möglichkeit der Signalverstärkung liegt in der Nutzung von enzymatischen Verfahren. Meine Arbeitsgruppe hat dazu eine DNA-origamibasierte Plattform entwickelt, welche mit Hilfe eines sogenannten DNA Walkers ein einzelnes DNA Zielmolekül nutzt, um eine Vielzahl von Farbstoffen auf einem DNA Origami durch Abspaltung eines Quenchermoleküls zu aktivieren. Durch die Einzelmolekülsensitivität des Mikroskops konnten der Prozess des „Walkings“ auf dem DNA Origami charakterisiert sowie die maximale Anzahl an freigesetzten Farbstoffmolekülen bestimmt werden.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1038/s41598-017-02395-8) - Shifting Molecular Localization by Plasmonic Coupling in a Single-Molecule Mirage, Nature Commun., 8, 13966, 2017
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(See online at https://doi.org/10.1038/ncomms13966)
