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Projekt
SP-5: Einzelmoleküluntersuchung von Biomolekülmustern
Antragsteller
Professor Dr. Michael Schlierf
Fachliche Zuordnung
Biophysik
Förderung
Förderung von 2014 bis 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 233120155
Biomineralisation in Diatomeen ist ein hochkomplexer Prozess, um die komplizierten und hochgradig regulären Muster auf der Nanometerebene der Silica-Zellwand von Diatomeen zu bilden. Eine Hypothese für diesen Prozess ist, dass die Biosilica Morphogenese auf einem Muster (in Zeit- und Ortsabhängigkeit) von Proteinen (silaffins, silacidins, cingulins, silicanins) in Kombination mit langkettigen Polyaminen (LCPA) basiert. Deswegen ist die Lokalisation mit größtmöglicher Genauigkeit dieser Proteine und der Korrelation mit dem Biosilica Muster besonders wichtig, um diese Hypothese zu testen und ein grundlegendes Verständnis der Biosilica Morphogenese zu erlangen. In der letzten Förderrunde haben wir Einzelmoleküllokalisationsmikroskopietechniken (SMLM) für die Diatomee T. pseudonana basierend auf photo-activatable localization microscopy (PALM) und stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) entwickelt. Wir haben drei verschiedene licht-konvertierbare fluoreszente Proteine identifiziert, die es uns als Fusionsproteine erlaubt haben, Silica eingebundene Proteine mit eine Auflösung von bis zu 25 nm zu lokalisieren (ca. 10-fach höhere Auflösung im Vergleich zu konfokaler Mikroskopie) Weiterhin haben wir diese Techniken verwendet, um die Positionen und Verteilungen der Cingulin Proteine in der Ammonium-fluorid unlöslichen organischen Matrix zu bestimmen. Im Gegensatz zu Epifluoreszenztechniken, die eine kontinuierliche Verteilung der Cingulinproteine in den Mikroringen zeigen, konnten wir in den super-resolution Bildern klare Bereich für eine CinW2 Position und CinY2 Position feststellen. In diesem Projekt werden wir mit Hilfe von Einzelmolekülfluoreszenztechniken folgende Fragen beantworten: 1) Welches Muster formt das Transmembraneprotein Silicanin-1 in der unlöslichen organischen Matrix der Mikroringe? 2) Welches Muster formen die löslichen Komponenten auf der unlöslichen organischen Matrix? 3) Welches Muster formt Silicanin-1 im SDV während der Biosilicabildung? Das erste Projekt fokussiert sich auf die in vitro Beobachtung mittels PALM und STORM, um relativ zu den Postionen der Cingulinproteine die Position des Silicanin-1 Proteins zu bestimmen. Weiterhin werden wir Protokolle zur korrelativen Fluoreszenz und Elektronenmikroskopie entwickeln, um die rekonstruierten super-resolution Daten mit den hochauflösenden, jedoch Protein-unspezifischen Elektronenmikroskopiedaten zu überlappen. Das zweite Projekt wird super-resolution Mikroskopie verwenden, um die Selbstassemblierung der löslichen Komponenten auf unlöslichen Komponenten zu beobachten. Das dritte Arbeitspaket fokussiert sich darauf, in lebenden Diatomeen mittels super-resolution Mikroskopie die Musterbildung von Silicanin-1 im SDV während der Valvenbiogenese zu beobachten.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
