Hochmodulares 2-Kanal-STED-Mikroskop für große Bildfelder
Final Report Abstract
Bei dem Gerät handelt es sich um ein hochmodulares 2-Kanal STED Mikroskop, das entsprechend der jeweiligen experimentellen Anforderungen ausgebaut und verändert werden kann. Das Mikroskop erlaubt das Abbilden immunomarkierter Zellen und Gewebe in großen Bildfeldern mit einer Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze (< 40 nm). In den ersten drei Jahren seit Inbetriebnahme wurde das Mikroskop zum einen in einer Reihe von unterschiedlichen Projekten zur Analyse von sub-zellulären und insbesondere von sub-mitochondrialen Proteinverteilungen eingesetzt. Zum anderen wurde es genutzt, um verschiedene Bildgebungsmodi und Farbstoffe systematisch zu evaluieren. Mit Hilfe dieses Mikroskops gelang es, die Proteinverteilung des Tumormarkers HER2 in eingebetteten Gewebeproben von kolorektalen Karzinomen darzustellen. Hierbei wurden sowohl frisch entnommene, als auch archivierte Gewebeschnitte aufbereitet und mittels des STED Mikroskops untersucht. Die Möglichkeit, nanoskalige Proteinverteilungen in archivierten humanen Gewebeschnitten zu erforschen und auszuwerten, könnte neue Ansätze für eine individualisierte Krebstherapie bereitstellen. Mitochondrien besitzen ihr eigenes genetisches System. Die mitochondriale DNA (mtDNA) kodiert für Untereinheiten der an der oxidativen Phosphorylierung beteiligten Proteinkomplexe. Zusammen mit spezifischen Proteinen bildet die mtDNA große Protein-DNA-Strukturen (Nukleoide). Veränderungen der Expression von mitochondrial kodierten Proteinen sind verbunden mit einer Vielzahl von humanen Krankheiten sowie mit Alterungsprozessen. Derzeit ist nur sehr wenig über die genaue räumliche Anordnung der mitochondrialen Genexpressionsmaschinerie bekannt. Das hochmodulares 2-Kanal STED Mikroskop wurde in einer Reihe von Studien eingesetzt, um die sub-mitochondriale Verteilung von Nukleoiden und ihrer Interaktionspartner zu erforschen. Wir konnten zeigen, dass die Nukleoide in humanen Zellen zwar im Durchschnitt eine sehr konstante Größe haben, individuelle Nukleoide aber, vermutlich in Abhängigkeit ihres Aktivitätsstatus, sehr unterschiedliche Formen annehmen können. Auch konnten wir belegen, dass ein Anstieg der Kopienzahl der mtDNAs zu einer Erhöhung der Zahl der Nukleoide pro Zelle, nicht aber zu einer Veränderung ihrer Größe führt. Dies hat weitreichende Konsequenzen für die Entwicklung von Modellen zur Regulation und Expression mitochondrialer DNA. In weiteren Untersuchungen wurde die Verteilung von mitochondrialen Genprodukten und mitochondrialen Ribosomen untersucht. Dabei konnten sehr große multi-Komponenten Expressosom-ähnliche Komplexe nachgewiesen werden, die mitochondrial organization of gene expression (MIOREX) Komplexe genannt wurden. Während der Mitochondrien-vermittelten Apoptose bilden die pro-apoptotischen Proteine Bax und Bak große multimere Proteinkomplexe in der äußeren mitochondrialen Membran, die dann zu der Freilassung von Cytochrom c und anderen Proteinen aus dem mitochondrialen Intermembranraum in das Zytosol führen. Mit Hilfe des 2-Kanal STED Mikroskops konnten wir nachweisen, dass zahlreiche aktivierte Bax- Moleküle unter anderem ringförmige Strukturen in der mitochondrialen Außenmembran bilden. Viele der Eigenschaften dieser Strukturen deuten auf aus Bax und Bak gebildete Poren hin. Diese neu entdeckten Poren spielen vermutlich eine zentrale Rolle während der Apoptose und werden derzeit mit Hilfe des STED Mikroskops detailliert untersucht. Begleitend zu diesen Untersuchungen wurden während des gesamten Zeitraumes verschiedene Aufnahmemodi und Farbstoffe systematisch getestet. Aus diesem Grund verfügen wir jetzt über detaillierte und gut ausgearbeitete Protokolle, die eine effiziente Nutzung des Mikroskops erlauben.
Publications
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