Design, Synthese und Untersuchung Kollagen-inspirierter Templat-[Protein]3-Hybride: Von hochmolekular schaltbaren Strukturbildnern zur Prozessierung Kollagen-artiger Materialien für die Zellkultur.
Polymermaterialien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die ursprüngliche Zielsetzung, kollagenmimetische Proteine basierend auf der Aminosäuresequenz (GPP)n sowohl chemisch als auch biotechnologisch herzustellen, konnte erreicht werden. Die chemische Funktionalisierung von Templatmolekülen auf der Basis von Tris(2-aminoethyl)amin mit Thioestern wurde als Zugangsroute implementiert, was den Einsatz der Template für die Native Chemische Ligation zur Erzeugung Templat-Vororientierter Peptide ermöglichte. Die Ligationsbedingungen dieser Reaktion konnten anhand niedermolekularer Peptide optimiert werden. Der Einbau eines schaltbaren Peptidsegmentes in die Templatstruktur wurde durch sukzessive Weiterentwicklung der Templateinheit ermöglicht, und die Schaltung der eingebauten Defekte führten zu einer Verbesserung der Strukturkontrolle und einer verstärkten Ausbildung kollagenartiger Tripelhelices. Die Verwendung dieser Templateinheiten zur Herstellung höhermolekularer Konstrukte stellte sich jedoch als recht problematisch heraus. Zum einen konnte eine intramolekulare Nebenreaktion beobachtet werden, die im niedermolekularen Bereich mit einer Vergrößerung der Templateinheit sowie höherem Einsatz der Peptidedukte minimiert werden konnte. Zum anderen stellte sich die schlechte Löslichkeit der hochmolekularen Konstrukte für diese Art der Ligation als problematisch heraus. Sodass eine Trimerisierung des [GPP]50 Unimers an ein Templat nicht erreicht werden konnte. Anstelle wurde ein Cystein-Organisationsdomäne entwickelt, die über Cysteinoxidation und Disulfid-Brückenbildung zur Vororganisation beitrug und nachweislich die Tripelhelixausbildung verbesserte. Die Nutzung einer Cystein-Organisationsdomäne hatte den Vorteil, dass derartige Sequenzen ohne chemische Modifikation direkt im biotechnologischen Prozess in das Unimer eingebracht werden können und demnach zwischen den kurzen, synthetischen Peptiden und den längeren, biotechnologisch produzierten Peptiden kein Unterschied besteht. Die redox-reaktive Schaltbarkeit stellt sich besonders zur Bestimmung von Trimerisierungskinetiken und Schmelztemperaturen als wertvolles Analysewerkzeug heraus. Die Schaltbarkeit mittels DEPSI-Peptidsegmenten konnte auch für dieses Peptid-basierte Templat- System angewendet werden. Somit konnten Schaltsegmente erfolgreich bei beiden Ligationsstrategien eingeführt und angewendet werden, was zur verbesserten Ausbildung der Kollagentripelhelix führte. Um die Verwendbarkeit der synthetischen Kollagene (eCols) als Biomaterial zu testen wurde des Weiteren die Kompatibilität in zweidimensionalen Adhäsions- und Zytotoxizitätstests überprüft. Es stellte sich dabei heraus, dass die Zelladhäsion, wie erwartet, für unmodifizierte Filme aus diesem eCol- Material äußerst schwach ist. Das lässt sich auf den Mangel an sonst in Kollagen vorhandenen Integrin- Bindestellen zurückführen und stellt eine hervorragende Eigenschaft für die Verwendung als Biomaterial in Anwendungen dar, bei denen eine übermäßige Zellinteraktion nicht erwünscht ist. Die mangelnde Interaktion mit Zellen beruht nicht auf toxischen Effekten. In kurzen über Festphasensynthese hergestellten Model eCols wurde ein C-terminales Zelladhäsionsmotiv eingeführt, welches die Integrin-Adhäsion wie erwartet begünstigte. Parallel dazu wurde die Mikrofluidik als Prozessierungsmethode von Kollagen eingesetzt. Vorerst wurde hier isoliertes Kollagen Typ I aus Kälberhaut zu Fasern versponnen. Interessanterweise ermöglichte dieser Prozess die Herstellung von Endlosfasern ohne notwendige Nachbehandlungsschritte zur Stabilisierung, wie z. B. Inkubation im Fällbad oder Vernetzungsreaktionen. Die Fasern zeigten einen homogenen Durchmesser und die Kollagenfibrillenorientierung längs der Faserachse wurde mittels polarisierter FTIR-Messungen bestätigt. Bemerkenswert ist zudem, dass die Fasern in Zugmessungen ein E-Modul und eine Zugfestigkeit zeigten, welche signifikant über der von nassgesponnenen Kollagenfasern und sogar über der mechanischen Stabilität von natürlichen Kollagenfasern aus dem Sehnengewebe lag. Der Faserdurchmesser (3,7 µm) war signifikant geringer als von Kollagenfasern aus bisherigen Nassspinnansätzen (>8 µm). Die mittels Mikrofluidik hergestellten Kollagenfasern ermöglichten in Zellkulturanalysen ein gerichtetes Wachstum der neuronalen Zelllinie NG108-15 entlang der Faserachse. Zudem zeigte diese Zelllinie die Ausbildung axonaler Strukturen, welche sich ebenfalls längs der Faserachse orientierten. Die hier hergestellten Kollagenfasern sind aufgrund ihrer mechanischen Stabilität ausgesprochen attraktiv für Anwendungen in der Biomedizin, z.B. als Nahtmaterial, zur Herstellung von Wundabdeckungen oder als Gerüstmaterial für die Gewebezüchtung. Überdies kann dieses hier entwickelte System ebenfalls genutzt werden, um die Assemblierung kollagen-inspirierter Proteine zu Fasern zu analysieren und die Fasereigenschaften in Korrelation zu dem verwendeten Proteinkonstrukt zu setzen (feedback loop). Eine zukünftige Kombination der in diesem Projekt erarbeiteten Methoden sollte die Herstellung kollagenbasierter Materialien ermöglichen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2018) Routes towards Novel Collagen-Like Biomaterials. Fibers 6 (2) 21
Golser, Adrian; Scheibel, Thomas
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/fib6020021) - Microfluidics-Produced Collagen Fibers Show Extraordinary Mechanical Properties. Nano Lett 2016, 16 (9), 5917-22
Haynl, C.; Hofmann, E.; Pawar, K.; Forster, S.; Scheibel, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.6b02828) - Biotechnological production of the mussel byssus derived collagen preColD. Rsc Adv 2017, 7, 38273-38278
Golser, A. V.; Scheibel, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c7ra04515h) - Engineered collagen - a redox switchable framework for tunable assembly, cellular adhesion and biocompatible fabrication. ACS Biomater. Sci. Eng. 2017
Golser A. V., Röber M., Börner H. G., Scheibel T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.7b00583)
