Method development for multiplexing bio imaging of single cells by use of LA-ICP-MS
Final Report Abstract
Das Ziel dieses Projektes war die Entwicklung einer analytischen Methode für ein multiplexfähiges quantitatives Imaging einzelner eukaryotischer Zellen mit elementmarkierten Antikörpern mittels LA-ICP-MS. Die Idee für die Entwicklung ICP-MS basierter Multiplex-Immunoassays basiert auf der einfachen Auswertung von Mass-Fingerprints, da die ICP-MS ein Multi-Element Detektor ist und viele Elemente des Periodensystems gleichzeitig bestimmt werden können. Weitere Vorteile liegen in ihrer hohen Genauigkeit und ihrem weiten linearen Messbereich. Das entscheidende Merkmal ICP-MS basierter Immunoassays ist die Modifizierung von Antikörpern mit künstlichen Elementlabeln. Diese dienen, wie Fluoreszenz-Farbstoffe, zum indirekten Nachweis der Zielproteine in der Zelle. Das Label ist kovalent an einen Antikörper gebunden, der wiederum an das Zielprotein (Antigen) spezifisch nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip andockt. Die Detektion des Elements mittels ICP-MS ermöglicht so die Identifizierung des Zielproteins. Für das Projekt stand ein Sektorfeld ICP-MS (Element XR, Thermo Scientific) gekoppelt mit einem New Wave NWR-213 Laser (ESI) zur Verfügung. Nach Optimierung der immunzytochemischen Färbung (ICC) für die ausgewählten Modellzellen (Maus 3T3 Fibroblasten) und der Scanbedingungen der Hardware konnte eine maximale Auflösung von 4 x 0.4 µm2 erreicht werden. Es wurde ein Antikörper-Mix zusammengestellt und erprobt, der es erlaubte den Zellzyklusstatus einzelner Zellen zu definieren. Weiter wurden einfache Metallfärbereagenzien etabliert, die es ermöglichten einzelne Zellen (und deren Zellkern) zu identifizieren, so dass für die Datenauswertung auf eine umständliche Überlagerung von Intensitätsprofilen mit Kamerafotos des Probenbereichs verzichtet werden kann. Im Fokus stand die Ausarbeitung eines Quantifizierungskonzepts, welches eine Zellulosemembran für die Kalibration nutzt. So konnten die Stoffmengen von acht künstlich eingeführten Lanthanid-Sonden, welche mit der Menge an markierten Antikörper-Antigen-Konjugaten korrelieren, sowie DNA und freie Thiolgruppen pro Zelle quantifiziert werden. Die instrumentellen Nachweisgrenzen lagen im atmol-Bereich. Die molaren Stoffmengen der künstlich eingeführten Elemente lagen zwischen ca. 0,07 und über 2,0 fmol/Zelle. Zum Ende dieses Projektes stand ein Protokoll, welches quantitative Analytik auf Einzelzellniveau mittels LA-ICP-MS Bildgebung erlaubt. Die Antikörper für das Projekt wurden so ausgewählt, dass sie eine grundlegende Charakterisierung der Zelle ermöglichten (Zellzyklus-Status, Zellform). Diese Charakterisierung ist Voraussetzung für die zukünftige Bearbeitung bioanalytischer Fragestellungen, wie der Zytotoxizität von Nanopartikeln oder Studien von metallhaltigen Medikamenten.
Publications
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Next generation of labeling reagents for quantitative and multiplexing immunoassays by use of LA-ICP-MS, Analyst 2016, Vol. 141, 6374-6380
S. Kanje, A. J. Herrmann, S. Hober and L. Mueller
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LA-ICP-MS Allows Quantitative Microscopy of Europium-Doped Iron Oxide Nanoparticles and is a Possible Alternative to Ambiguous Prussian Blue Iron Staining, J. Biomed. Nanotechnol. 2016, Vol. 12, No. 5
C. Scharlach and L. Mueller, S. Wagner, Y. Kobayashi, H. Kratz, M. Ebert, N. Jakubowski, E. Schellenberger
