Kartierung von Protein-Peptid- und Protein-Proteinwechselwirkungen mittels genetisch kodierte Photocrosslinker

• Antragstellerin: Professorin Dr. Irene Coin
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2013 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 236346005

Ziel des Projektes ist es, eine generelle Methode zur Untersuchung von Peptid-Protein- und Protein-Proteinwechselwirkungen in intakten Säugerzellen zu etablieren, die auf einer Verwendung unnatürlicher Aminosäuren zur Mutagenese und dem Photoaffitätscrosslinking beruht. Damit soll ein Verfahren zur Beschreibung der Topologie von Wechselwirkungsbereichen als auch zum Auffinden unbekannter Wechselwirkungen von Proteinen entwickelt werden. Unsere Forschung konzentriert sich vorerst auf ein Membranprotein, den Corticotropin Releasing Factor Rezeptor Subtyp 1 (CRFR1), der zur Klasse B der GPCRs gehört und von erheblicher Bedeutung für die Reaktion des Körpers auf Stressstimuli ist. Wir werden Bibliotheken von CRFR1-Mutanten verwenden, die eine einzelne, photoaktivierbare Aminosäure p-Azido-Phe (Azi) an jeder Position ausgewählter Domänen enthalten, um für diese Positionen zu testen, ob Peptidliganden crossgelinkt werden können. Auf diese Weise haben wir gerade die Topologie der Bindungstasche der J-Domäne des CRFR1 für dessen natürlichen Polypeptidagonisten Ucn-I aufklären können. Im Projekt A wollen wir solche Crosslinkingkartierungen für Peptidliganden mit ganz unterschiedlichen Gs/Gi-Proteinaktivierungseigenschaften durchführen. Parallel dazu soll auch untersucht werden, wie sich eine Kopplung des Rezeptor mit spezifischen G-Proteinen auf die Wechselwirkungsbereiche innerhalb des CRFR1-Ucn-I-Komplexes auswirkt. Damit wollen wir erste Informationen über molekulare Faktoren erhalten, die zur Steuerung unterschiedlicher Signalwege führen. Das Projekt B ist auf die Identifizierung individueller Aminosäuren, die beim Crosslinking erreicht werden, gerichtet. Wir werden dazu einerseits die Azid-Alkin-Clickreaktion für ein ortsspezifisches, chemisches Crosslinking zwischen Azi-Resten in Rezeptormutanten und Propargylglyzinresten, die in unterschiedliche Positionen des Liganden eingebaut werden, verwenden. Parallel werden wir eine Methode zur Reinigung crossgelinkter Rezeptoren mittels Flag-tag in Kombination mit einem Biotin-tag entwickeln. Biotin wird dabei posttranslational durch eine Sortase A-katalysierte Transpeptidierung eingeführt. Eine Optimierung des enzymatischen Verdaus soll anschließend zu crossgelinkten Fragmenten führen, die eine MS/MS-Analyse ermöglichen. Die Ergebnisse werden zur Bestimmung der räumlichen Orientierung des Liganden innerhalb der Bindungstasche des Rezeptors führen und die Entwicklung eines ersten detailierten Bindungsmodells erlauben. Im Rahmen von Projekt C werden wir Aminosäuren mit Benzophenon- oder Diazirinseitenketten in Lipid-orientierte Positionen der Transmembrandomänen vom CRFR1 mit dem Ziel einbauen, die Interaktionsseiten der Homodimerbildung von CRFR1 zu bestimmen. Dieselben Rezeptormutanten sollen auch dazu dienen, andere Proteine, die transmembranär am Rezeptor assoziieren, fischen zu können, was mit den gegenwärtigen Methoden nicht möglich ist. Crossgelinkte Proteine werden nach den in Projekt B entwickelten Verfahren angereichert, und assoziierte Proteine können mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. Dieselbe Vorgehensweise werden wir nutzen, um die Wechselwirkung zwischen dem Subtyp 2 vom CRFR und dem Oncoprotein ErbB2 zu kartieren und auf weitere Sicht auch Wechselwirkungen intrazellulärer Domänen zu untersuchen. In Zukunft soll es die Methode ermöglichen, eine Protein-Proteinwechselwirkung, ob als Element von Signalkaskaden oder anderer zellulärer Vorgänge, in der natürlichen Umgebung von intakten Zellen zu untersuchen.

• DFG-Verfahren: Emmy Noether-Nachwuchsgruppen