Durchflusszytometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Am Forschungszentrum „Kubus“ des Dr. von Haunerschen Kinderspitals wurde 2014 eine Facility für durchflusszytometrische Arbeiten eingerichtet, ausgestattet unter anderem mit einem state-of-the-art 5-Laser Durchflusszytometer. Im Kubus sind Forschungsgruppen der Pädiatrie und Kinderchirurgie des Klinikums der Universität München tätig. Seit 2015 ist auch die Abteilung für Klinische Pharmakologie in Forschungsflächen im gleichen Gebäude eingezogen. Forschungsschwerpunkte des Standorts bilden die Immunologie, Hämatologie, Onkologie und Genetik. Die Facility steht allen Wissenschaftlern des Kubus offen. Darüber hinaus können Arbeitsgruppen aus anderen Einrichtungen des Klinikums, Kollaborationspartner und Netzwerke das Durchflusszytometer nutzen, wenn es die Auslastung ermöglicht. Federführend betreut wird die Facility durch die Arbeitsgruppe von Prof. Christoph Klein, Direktor der Kinderklinik und Kinderpoliklinik im Dr. von Haunerschen Kinderspital. Ein wesentlicher Forschungsschwerpunkt der AG Klein besteht darin, die molekularen Krankheitsursachen von primären Immundefekten (PID) und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen bei Kindern aufzuklären. Hierbei nehmen durchflusszytometrische Analysen eine zentrale Bedeutung in der Aufarbeitung der Immunphänotypen (z.B. Multicolor-Immunphänotypisierung, Untersuchung der T- und B- Zellaktivierung/-proliferation) ein. Darüber hinaus werden zahlreiche weiterführende funktionelle durchflusszytometrische Assays durchgeführt, um zugrundeliegende molekulare Krankheitsmechanismen zu charakterisieren; z.B. Analysen des Zellzyklus oder der Signaltransduktion. In den letzten Jahren konnten mehrere neue Gendefekte identifiziert und unter Nutzung der Facility charakterisiert werden. Beispielsweise konnte SMARCD2, eine Untereinheit des SWI/SNF-Chromatin Remodelling Komplexes, als Schlüsselfaktor der Myelopoese und als Tumorsuppressor charakterisiert werden. SMARCD2 loss-of-function Mutationen wurden mittels Whole Exome Sequencing (WES) in Patienten aus 3 Familien identifiziert, die durch Neutropenie, Spezifische Granula Defizienz und Myelodysplasie mit Blastenexzess aufgefallen waren. In Maus- und Zebrafischmodellen konnte gezeigt werden, dass SMARCD2 die Differenzierung von myeloiden-erythroiden Progenitorzellen reguliert. Die entsprechende Immunphänotypisierung der murinen Blutzellen basiert auf durchflusszytometrischen Messungen. In einem weiteren Projekt konnte die MYSM1-Defizienz als Ursache für syndromatisches Knochenmarksversagen mit B-Zellen-Immundefizienz und Neutropenie identifiziert werden. MYSM1 reguliert die Transkription und deubiquitiniert Histone. MYSM1-defiziente Zellen weisen eine erhöhte Sensitivität gegenüber genotoxischem Stress auf: In immortalisierten B-Zellen der Patienten vs. Kontrollen zeigten sich erhöhte γH2AX-Level in der Durchflusszytometrie. Primäre PBMCs der Patienten zeigten einen langsameren Abbau von γH2AX nach UV-induzierten DNA Schäden. Zudem wurden in MYSM1-defizienten Fibroblasten der Zellzyklus und die Apoptoserate nach UV-induzierten DNA Schäden mittels DAPI-Färbung durchflusszytometrisch analysiert. Es wurden erhöhte Apoptoseraten und ein verlängerter Arrest in der G1-Phase gefunden. Eine Rolle von MYSM1 in der Kontrolle der Zellantwort auf genotoxischen Stress konnte so gezeigt werden. In weiteren vier Patienten (zwei konsanguinen Familien) konnten Mutationen in CARMIL2 als Ursache von seltenen Epstein-Barr-Virus-assoziierten Weichteiltumoren mittels WES identifiziert werden. Phänotypische und funktionelle Analysen zeigten, dass die CARMIL2-Defizienz zu Defekten im CD28 Co-Signalling mit beeinträchtigter T-Zell-Aktivierung, -Differenzierung und -Funktion führt. Diese Analysen wurden in erster Linie mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die AG von Prof. Tobias Feuchtinger an der Kinderklinik befasst sich mit der Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren für die Behandlung von malignen Erkrankungen und Virusinfektionen bei pädiatrischen onkologischen Patienten. Durchflusszytometrische Analysen dienen dabei der Charakterisierung von T-Zellen, der Messung der Proliferationskapazität und des Cytokine-Releases sowie der Expressionsanalyse von Immuncheckpoints auf malignen Zellen und T-Zellen. In der Abteilung für Klinische Pharmakologie hat die Arbeitsgruppe um Prof. Stefan Endres und PD Dr. Sebastian Kobold wichtige Forschungsergebnisse im Bereich der Zelltherapie und der Therapie mit TLR7-Agonisten erzielt und publiziert. Es konnten neue therapeutische Moleküle entwickelt werden, die in T-Zellen eingebaut die Wirksamkeit dieser Zellen gegen Tumoren verbessern. Die Durchflusszytometrie hat dabei einen entscheidenden Beitrag bei der phänotypischen Analyse der modifizierten T-Zellen und der Tumorumgebung geleistet. Darüber hinaus bestehen Kooperationen mit weiteren Einrichtungen der LMU, die die Facility u.a. für Forschungsprojekte auf dem Gebiet des Colon- und Pankreaskarzinoms (AG Jung, Pathologisches Institut) oder der zellulären Immunität in der chronischen HIV-Infektion (AG Draenert, Klinische Infektiologie) nutzen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- “Impact of a New Fusion Receptor on PD-1- Mediated Immunosuppression in Adoptive T Cell Therapy” Journal of the National Cancer Institute, 2015; 107
Kobold S, Grassmann S, Chaloupka M, Lampert C, Wenk S, Kraus F, Rapp M, Düwell P, Zeng Y, Schmollinger JC, Schnurr M, Endres S, Rothenfußer S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1093/jnci/djv146) - “A novel TLR7 agonist reverses NK cell anergy and cures RMA-S lymphoma-bearing mice” Oncoimmunology, 2016 5:e1189051
Wiedemann GM, Jacobi SJ, Chaloupka M, Krächan A, Hamm S, Strobl S, Baumgartner R, Rothenfusser S, Duewell P, Endres S, Kobold S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1080/2162402X.2016.1189051) - “C-C chemokine receptor type-4 transduction of T cells enhances interaction with dendritic cells, tumor infiltration and therapeutic efficacy of adoptive T cell transfer” Oncoimmunology, 2016 5:e1105428
Rapp M, Grassmann S, Chaloupka M, Layritz P, Kruger S, Ormanns S, Rataj F, Janssen KP, Endres S, Anz D, Kobold S
(Siehe online unter https://doi.org/10.1080/2162402X.2015.1105428) - “T-cell responses against CD19+ pediatric acute lymphoblastic leukemia mediated by bispecific T- cell engager (BiTE) are regulated contrarily by PD-L1 and CD80/CD86 on leukemic blasts.” Oncotarget. 2016; 7:76902-76919
Feucht J, Kayser S, Gorodezki D, Hamieh M, Döring M, Blaeschke F, Schlegel P, Bösmüller H, Quintanilla-Fend L, Ebinger M, Lang P, Handgretinger R, Feuchtinger T
(Siehe online unter https://doi.org/10.18632/oncotarget.12357) - “A human immunodeficiency syndrome caused by mutations in CARMIL2“ Nature Communications, 2017, 8:14209
Schober T, Magg T, Laschinger M, Rohlfs M, Linhares ND, Puchalka J, Weisser T, Fehlner K, Mautner J, Walz C, Hussein K, Jaeger G, Kammer B, Schmid I, Bahia M, Pena SD, Behrends U, Belohradsky BH, Klein C, Hauck F
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ncomms14209) - “Chromatin-remodeling factor SMARCD2 regulates transcriptional networks controlling differentiation of neutrophil granulocytes“ Nature Genetics, 2017, 49:742-752
Witzel M, Petersheim D, Fan Y, Bahrami E, Racek T, Rohlfs M, Puchałka J, Mertes C, Gagneur J, Ziegenhain C, Enard W, Stray- Pedersen A, Arkwright PD, Abboud MR, Pazhakh V, Lieschke GJ, Krawitz PM, Dahlhoff M, Schneider MR, Wolf E, Horny HP, Schmidt H, Schäffer AA, Klein C
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/ng.3833) - “MRD response in a refractory paediatric T-ALL patient through Anti-Programmed cell death 1 (PD-1) Antibody treatment associated with induction of fatal Graft versus Host disease.” Bone Marrow Transplant. 2017; 52:1221-1224
Boekstegers A-M, Blaeschke F, Schmid I, Wiebking V, Immler S, Hoffmann F, Bochmann K, Mueller S, Gruenewald T, Feucht J, Feuchtinger T
(Siehe online unter https://doi.org/10.1038/bmt.2017.107) - “Myb-like, SWIRM, and MPN domains 1 (MYSM1) deficiency: Genotoxic stressassociated bone marrow failure and developmental aberrations“ Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2017
Bahrami E, Witzel M, Racek T, Puchałka J, Hollizeck S, Greif-Kohistani N, Kotlarz D, Horny HP, Feederle R, Schmidt H, Sherkat R, Steinemann D, Göhring G, Schlegelbeger B, Albert MH, Al-Herz W, Klein C
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.10.053)
