High-content imaging System (Zellparameter-Screening-System)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das bewilligte Forschungsgroßgerät „High Content Imaging System“ (Hochdurchsatzmikroskop) wurde in allen Abteilungen des Pharmazeutischen Instituts eingesetzt. Es lieferte Daten in den inhaltlich und methodisch stark heterogenen Disziplinen der Pharmazie: Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Pharmazeutische Biologie und Pharmazeutische Technologie. Insbesondere im Bereich der Pharmazeutischen und Medizinischen Chemie, dem Hauptnutzungsbereich entsprechend dem Antrag, gingen die Daten in mehrere Publikationen und Abschlussarbeiten ein. Ein High Content Imaging System zeichnet sich durch automatisierte mikroskopische Aufnahmen einschließlich der Auswertung von einer mittleren bis großen Anzahl an Proben aus. Entsprechend haben wir das Gerät für verschiedene Varianten von Screenings zur Suche von potenziellen neuen Wirkstoff-Targets und Wirkstoff-Molekülen, deren Aufnahme in die Zellen, sowie Effekte auf zellulärer Ebene eingesetzt. Die folgenden publizierten Ergebnisse zeigen Anwendungen in den verschiedenen Bereichen: 1. Zellmotilität und Volumenregulation bei osmotischem Stress. Die Beweglichkeit von Zellen spielt in der Physiologie (z.B. Immunzellen) und Pathophysiologie (z.B. Tumor-Metastasierung) eine fundamentale Rolle. Die zugrunde liegenden molekularen/zellulären Prozesse sind jedoch nicht abschließend geklärt. Am amöboiden Modellorganismus Dictyostelium discoideum konnten wir mit Hilfe des High Content Imaging Systems zeigen, wie Membranproteine der Tetraspaninund Aquaporin-Familien die Zellmotilität und Volumenregulation beeinflussen. Aus Serien von Auflicht- Aufnahmen haben wir Zeitraffer-Filme von Wildtyp-, knockout- und Überexpressionszelllinien generiert. Aufgrund der großen Zahl analysierter Zellen erhielten wir signifikante quantitative Daten u.a. zur Direktionalität der Zellwanderung und zur Zellschwellung bei osmotischem Stress (Parameter roundness). 2. Prodrugs zur verbesserten Bioverfügbarkeit Stickstoffmonoxid-(NO)-freisetzender Verbindungen. Zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung mit endothelialer Dysfunktion werden stabile, bioaktivierbare Verbindungen zur Freisetzung von NO benötigt. Im Projekt wurde ein hervorragendes aber ω schlecht bioverfügbares Substrat der NO-Synthase, N -Hydroxy-L-arginin, chemisch mit einer Serie von Monosacchariden gekoppelt und deren Aufnahme in Zellen sowie die NO-Freisetzung systematisch analysiert. Mit Hilfe des High Content Imaging Systems wurde ein entsprechender quantitativer Fluoreszenz-Assay automatisiert. Mit dem Screening-Projekt gelang somit ein proof-of-concept für neue bioverfügbare NO-freisetzende Prodrugs. 3. Photosensibilität von Kinase-Inhibitoren. Dabrafenib wurde kürzlich zur Behandlung von Melanom-Krebspatienten mit einer speziellen Kinase-Mutation BRAFV600E zugelassen. Mit Hilfe des High Content Imaging Systems konnten wir zeigen, dass eine vorher unbekannte photo-induzierte chemische Umwandlung des Wirkstoffs zu einer planaren Fluoreszenz-Verbindung führt, die ebenfalls die BRAFV600E Kinase potent hemmt. Hierzu wurden die Funktionen des High Content Imaging Systems zur automatisierten Analyse von Zell-Vitalitätsparametern eingesetzt. Die Ergebnisse haben Bedeutung für die präklinische Forschung und klinische Anwendung von Dabrafenib. 4. Verwendung von Nanokristallen zur Wirkstoffapplikation. Die Verwendung von Nanopartikeln findet immer weitere Anwendung, nicht nur im pharmazeutischen Bereich. Wir haben untersucht, ob die typische Erhöhung der oralen Bioverfügbarkeit von schwerlöslichen Substanzen aus Nanokristallen auf einer schnelleren Auflösegeschwindigkeit der nanometer-kleinen Strukturen beruht oder ob die Kristalle selbst auch in nennenswertem Ausmaß von Epithelzellen des Gastro-Intestinaltraktes aufgenommen werden. Hierfür wurde eine Darmkrebszelllinie (Caco-2) mit generierten autofluoreszierenden Nanokristallen bestehend aus Curcumin oder Glibenclamid inkubiert. Bisher haben wir keine Kristalle innerhalb der Zellen gefunden, jedoch bestätigte sich eine beschleunigte Auflösung und Aufnahme der nanokristallinen Substanzen durch diffuse Fluoreszenz in den Zellen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- The amoeboidal Dictyostelium aquaporin AqpB is gated via Tyr216 and aqpB gene deletion affects random cell motility. Biol. Cell, 2015, 107: 78-88
von Bülow, J., Golldack, A., Albers, T., Beitz, E.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1111/boc.201400070) - Design, Synthesis, and Bioactivation of O-Glycosylated Prodrugs of the Natural Nitric Oxide Precursor Nω-Hydroxy- L-arginine. J. Med. Chem., 2016, 59: 8030-8041
Litty, F.A., Gudd, J., Girreser, U., Clement, B., Schade, D.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6b00810) - Photoinduced conversion of antimelanoma agent dabrafenib to a novel fluorescent BRAFV600E inhibitor. ACS Med. Chem. Lett., 2016,
Pinchuk, B., von Drathen, T., Opel, V., Peifer, C.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.6b00340) - The C isoform of Dictyostelium tetraspanins localizes to the contractile vacuole and contributes to resistance against osmotic stress. PLoS One, 2016, 11: e0162065
Albers, T., Maniak, M., Beitz, E., von Bülow, J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0162065)
