Intramyokardiale Transplantation von bioartifiziellen iPS-Myokard-Splints zur Restauration von ischämischem Myokard im Rattenmodell. In vivo Evaluation von Transplantatüberleben und linksventrikulärer Funktion
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Trotz der technischen Fortschritte im Bereich der interventionellen Koronarrevaskularisation und der mechanischen Herzunterstützungssysteme, ist es bisher nicht gelungen, geschädigte Herzmuskelzellen im ischämischen Myokard zu ersetzen. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe hatte sich gezeigt, dass bei direkter intramyokardialer Injektion von Zellsuspensionen ein erheblicher Verlust dieser Zellen in die Lungenstrombahn auftritt. Somit können die verbliebenen Transplantate ihre Wirkung am Herzen nicht in ausreichendem Maße entfalten. Die Viskositätssteigerung der Trägersubstanz mit Fibrinogen führte zu einer Reduktion des Zellverlustes. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden in dem aktuellen Projekt solide, in unserer Arbeitsgruppe etablierte Gewebekonstrukte (BCTs) appliziert, um die Problematik des Zellverlustes durch Auswaschphänomene vollständig zu beheben. Im ersten Abschnitt des Projektes sollte die Applikationsmethode epikardial versus intramyokardial für solide Konstrukte evaluiert werden. Die intramyokardiale Applikationsmethode wurde in unserer Arbeitsgruppe mit einer besonderen Hohlnadeltechnik zunächst etabliert. Kardiomyozyten-haltige BCTs und Kardiomyozyten-freie Fibroblasten-haltige Konstrukte aus GFP-positiven neonatalen Rattenherzen wurden hergestellt und syngen in Lewisratten epikardial oder intraymokardial 14 Tage nach chronischer Infarktinduktion (LAD Ligatur) appliziert. Intramyokardial applizierte Kardiomyozytenhaltige BCTs erbrachten die besten funktionellen Ergebnisse im MRI und in der Echokardiographie vier Wochen nach Gewebetransplantation. Auch bezüglich des Transplantatüberlebens und der Transplantatvaskularisation zeigte die Kardiomyozyten-haltige BCT-Gruppe die besten Resultate. Eine mögliche Erklärung wäre die Dicke der Bindegewebsschicht, die sich zwischen Transplantat und Empfängermyokard bildete. Sie war um das 4-fache größer in der epikardialen Gruppe im Vergleich zu den intramyokardial applizierten Transplantaten. Da die Transplantate nicht über eine eigene Gefäßversorgung verfügen, sind sie auf zügige Neo-Vaskularisation und Nutrition durch das Empfängergewebe angewiesen. Basierend auf diesen Ergebnisse wurde die intramyokardiale Transplantationsmethode als Methode der Wahl für den nächsten Projektabschnitt festgelegt. Im zweiten Versuchsvorhaben wurden auf iPS-Zellen basierende Kardiomyozytenkonstrukte und deren Kardiomyozyten-freie Kontrollgruppen intramyokardial appliziert. Zum damaligen Zeitpunkt standen uns ausschließlich auf murinen iPS-Zellen basierende Kardiomyozytenkontrukte zur Verfügung. Aufgrund der Größe der Konstrukte war eine intramyokardiale Applikation im allogenen Mausmodell nicht durchführbar. Alternativ entschieden wir uns für eine xenogene Transplantation der Konstrukte in ein immundefizientes Nacktrattenmodell. Allerdings verfügten auch die verwendeten Nacktratten über immunologisch aktiv zirkulierende Zellen. Nachdem die zytotoxische Wirkung der NK-Zellen dieser Nacktratten auf die BCT-Zellen in vitro nachgewiesen wurde, wurden die NK-Zellen in den Spendertieren mit dem NK-Zellantikörper (HT30) depletiert. Die murinen iPS-basierten BCTs (mBCT-Gruppe) bestanden zwar hauptsächlich aus Kardiomyozyten, sie enthielten aber auch ca. 10% murine embyonale Fibroblasten (MEF) zur mechanischen Stabilisierung der Konstrukte. Die in der Literatur beschriebene immunmodulierende Wirkung von humanen Vorhautfibroblasten (HFF-1) bewegte uns dazu in einer zweiten Gruppe, BCTs herzustellen, in denen der Anteil an MEFs durch HFFs ersetzt wurde (hBCT-Gruppe). Als Kontrollgruppe zu jeder Kardiomyozyten-haltigen Gruppe wurden Kardiomyozyten-freie Fibroblastenkontrukte aus HFFs (hFT) und MEFs (mFT) intramyokardial implantiert. Die funktionellen Ergebnisse (Echokardiographie, MRI) der ersten syngenen Versuchsreihe wurden auch in der zweiten xenogenen Versuchsreihe bestätigt. Vier Wochen nach Transplantation führten beide Kardiomyozyten-haltigen Grafts (mBCT und hBCT) zur signifikanten Verbesserung der Pumpleistung sowohl im Vergleich zu den Kardiomyozyten-freien Kontrollgruppen (hFT und mFT) als auch zur Sham-Gruppe, bei welcher lediglich Infarkt und Rethorakotomie durchgeführt wurden. Die Immunhistologie der Explantate zeigte, dass die Kardiomyozyten der hBCT- Gruppe ein signifikant besseres Überleben aufwiesen als die der mBCT-Gruppe. Alle Implantate wiesen eine Vaskularisierung auf, wobei die HFF-haltigen Transplantate (hBCT, hFT) eine signifikant höhere Anzahl an Gefäßen besaßen als die MEF-basierten Konstrukte (mBCT, mFT). Zum besseren Verständnis der vermutlich immunmodulatorischen Wirkung der humanen Vorhautfibroblasten (HFF) auf das Immunsystem des Empfängertieres wurden MEFs und HFFs mit Empfängerleukozyten in vitro für 5 Tage inkubiert. Die Durchflusszytometrie nach 5 Tagen zeigte, dass der Anteil von CD3neg/CD4pos Zellen in den HFF-Ko-Kulturen deutlich niedriger lag (35%) als in den MEF-Ko-Kulturen (60%). Das bedeutet, dass die CD3neg/CD4pos Zellen in Anwesenheit von HFFs weniger stark proliferieren als in Anwesenheit von MEFs. Diese Resultate liefern Hinweise darauf, dass die transplantierten Kardiomyozyten der hBCT-Gruppe vermutlich durch eine verminderte Abstoßungsreaktion ein besseres Überleben aufwiesen, als die MEF-basierten Konstrukte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass iPS-Zell-basierte Kardiomyozytenkonstrukte vier Wochen nach Implantation überleben und die Herzfunktion im chronischen Infarktmodell verbessern. Übertragen auf das Großtiermodell wäre die Implantation von multiplen kleinen Konstrukten (BCT-Splints) im Bereich des Infarktgebietes gut umsetzbar. Die immunmodulatorischen Effekte von ko-transpantierten Zellen sowie der sichere Nachweis der elektromechanischen Kopplung bleiben weiterhin zukünftige Forschungsfelder.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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In vivo Integration of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Bioartificial Cardiac Tissue. Circulation 2013, 128 (22 Supplement):A12878
Saito S, Kensah G, Baraki H, Bakar M, Dahlmann J, Skvorc D, Hundrieser J, Trautewig B, Sasse P, Wedekind, Meier M, Haverich A, Martin, U, Kutschka I
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Different degrees of protective effect by types of fibroblasts on induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in bioartificial cardiac tissue in vivo. Thorac cardiovasc Surg 2014; 62 - SC7
Saito S, Kensah G, Baraki H, Dahlmann J, Haverich A, Hundrieser J, Martin U, Gruh I, Kutschka I
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Effect of natural killer cells on induced pluripotent stem cell-derived cardiac tissue. Thorac cardiovasc Surg 2014; 62 - SC5
Kensah G, Baraki H, Saito S, Dahlmann J, Skvorc D, Hundrieser J, Kutschka I, Martin U, Gruh I
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iPS cell-mediated left ventricular regeneration after chronic myocardial infarction. „Cardiac Regeneration and Vascular Biology“ Conference 2014
Kensah G, Baraki H, Saito S, Dahlmann J, Haverich A, Hundrieser J, Martin U, Gruh I, Kutschka I
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Vital and Integrated iPSC-derived Bioartificial Cardiac Tissue Restores Function in a Model of Chronic Myocardial Infarction. Keystone Symposia Stem Cells and Reprogramming 2014, Z4 2018
Saito S, Kensah G, Baraki H, Dahlmann J, Skvorc S, Trautewig B, Hundrieser J, Wedekind D, Meier M, Haverich A, Martin U, Gruh I, Kutschka I
