Gepulstes Lasersystem für höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Final Report Abstract
Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere mit Einzelmolekülempfindlichkeit, wird in der Gruppe Nienhaus in diversen Projekten zur Untersuchung der biomolekularen Strukturdynamik eingesetzt. 1. Untersuchung der Protein-Nanopartikel- und Nanopartikel-Zell-Wechselwirkungen (im Rahmen des SPP1313): Nanopartikel werden einerseits als wichtige Werkzeuge in der medizinischen Diagnostik und Therapie betrachtet, andererseits gibt es Bedenken, dass sie gesundheitlich problematisch sein können bei nicht beabsichtigter Exposition und Inkorporation, die bei der industriellen Verwendung unvermeidbar ist. In biologischen Fluiden (z. B. Blut, Lymphe, Lungenflüssigkeit) werden Nanopartikel sofort von einer Proteinadsorptionsschicht (Proteinkorona) eingehüllt, die die eigentlichen physikochemischen Eigenschaften der Partikel maskiert und stattdessen die Interaktion der Nanopartikel mit Biomaterialen wie z. B. Zellen bestimmt. Wir verwenden die Zwei-Fokus-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (2fFCS), um die Adsorption von Proteinen auf fluoreszenten Nanopartikeln quantitativ zu untersuchen. Insbesondere werden die Dicke der Proteinkorona, Bindungsaffinitäten, Reversibilität der Adsorption, oder auch kinetische Ratenkoeffizienten bestimmt. FCS basiert auf der Detektion der Emission einzelner Fluorophore, wenn diese durch das konfokale Volumen des Mikroskops diffundieren. Die Teilchenmobilität ändert sich mit der Größe der diffundierenden Teilchen, und Radiusänderungen von etwa 0.1 nm können quantitativ bestimmt werden. Fluoreszente Nanopartikel (z.B. Quantenpunkte, Gold/Silbernanocluster) werden in der Arbeitsgruppe synthetisiert. Die Charakterisierung eines jeden neuen Labels umfasst stets die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer. So zeigen Goldnanocluster eine stark temperaturabhängige Fluoreszenzlebensdauer und -intensität im physiologischen Temperaturbereich (15 – 45 °C). Mithilfe der auf zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung (time-correlated single photon counting, TCSPC) basierenden Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) konnten wir die Anwendung von Goldnanoclustern für die lokale Temperaturmessung in lebenden Zellen aufzeigen. 2. Stabilität und Funktion von Proteinen in nanostrukturierten Umgebungen: Proteine sind dynamische Makromoleküle, die ständig zwischen verschiedenen Konformationen fluktuieren. Durch systematische Beobachtungen von Strukturfluktuationen einer Anzahl wohlselektierter Modellproteine durch zeitlich aufgelöste Messungen des FRET Signals werden Details der Faltungsdynamik analysiert, zum Beispiel die Existenz von Faltungsintermediaten. Neben Faltungsübergängen werden Strukturfluktuationen im gefalteten Zustand untersucht. Bei diesen Arbeiten wurde die Multiparameter-Detektion verwendet: Die simultane Erfassung der Intensität, der Polarisation sowie der Fluoreszenzlebensdauer in zwei Farbkanälen ermöglicht eine optimale Charakterisierung von Konformationsfluktuationen. 3. Konformationsfluktuationen und Strukturänderungen kleiner Nukleinsäuremoleküle: Mithilfe von Einzelmolekül-FRET-Messungen haben wir die molekulare Dynamik der Konformationsumwandlungen kleiner Nukleinsäuremoleküle in Echtzeit beobachtet. Neben enzymatisch aktiven RNAs (Ribozyme) haben wir insbesondere Riboswitches untersucht. Bei ihnen bewirkt das Anbinden eines Metaboliten an die Sensordomäne eine strukturelle Reorganisation der RNA, wodurch die Proteinproduktion beeinflusst wird. 4. Entwicklung von Methoden zur Analyse von Multidomänenproteinen und deren Anwendung auf die Untersuchung von Zellpolaritätsproteinen in vitro und in vivo: Im Rahmen dieses Projektes wurden die Eigenschaften von SNAPtag und CLIPtag Domänen als FRET- Paar charakterisiert. Diese Proteine können orthogonal mit spezifischen synthetischen Farbstoffen markiert werden und werden deshalb in zellulären Anwendungen als Fusionspartner eingesetzt. Wir haben hier zunächst insbesondere SNAPtag-CLIPtag Fusionsproteine mit variierenden Linkerpeptiden im Detail untersucht.
Publications
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