Gepulstes Lasersystem für höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere mit Einzelmolekülempfindlichkeit, wird in der Gruppe Nienhaus in diversen Projekten zur Untersuchung der biomolekularen Strukturdynamik eingesetzt. 1. Untersuchung der Protein-Nanopartikel- und Nanopartikel-Zell-Wechselwirkungen (im Rahmen des SPP1313): Nanopartikel werden einerseits als wichtige Werkzeuge in der medizinischen Diagnostik und Therapie betrachtet, andererseits gibt es Bedenken, dass sie gesundheitlich problematisch sein können bei nicht beabsichtigter Exposition und Inkorporation, die bei der industriellen Verwendung unvermeidbar ist. In biologischen Fluiden (z. B. Blut, Lymphe, Lungenflüssigkeit) werden Nanopartikel sofort von einer Proteinadsorptionsschicht (Proteinkorona) eingehüllt, die die eigentlichen physikochemischen Eigenschaften der Partikel maskiert und stattdessen die Interaktion der Nanopartikel mit Biomaterialen wie z. B. Zellen bestimmt. Wir verwenden die Zwei-Fokus-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (2fFCS), um die Adsorption von Proteinen auf fluoreszenten Nanopartikeln quantitativ zu untersuchen. Insbesondere werden die Dicke der Proteinkorona, Bindungsaffinitäten, Reversibilität der Adsorption, oder auch kinetische Ratenkoeffizienten bestimmt. FCS basiert auf der Detektion der Emission einzelner Fluorophore, wenn diese durch das konfokale Volumen des Mikroskops diffundieren. Die Teilchenmobilität ändert sich mit der Größe der diffundierenden Teilchen, und Radiusänderungen von etwa 0.1 nm können quantitativ bestimmt werden. Fluoreszente Nanopartikel (z.B. Quantenpunkte, Gold/Silbernanocluster) werden in der Arbeitsgruppe synthetisiert. Die Charakterisierung eines jeden neuen Labels umfasst stets die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer. So zeigen Goldnanocluster eine stark temperaturabhängige Fluoreszenzlebensdauer und -intensität im physiologischen Temperaturbereich (15 – 45 °C). Mithilfe der auf zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung (time-correlated single photon counting, TCSPC) basierenden Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) konnten wir die Anwendung von Goldnanoclustern für die lokale Temperaturmessung in lebenden Zellen aufzeigen. 2. Stabilität und Funktion von Proteinen in nanostrukturierten Umgebungen: Proteine sind dynamische Makromoleküle, die ständig zwischen verschiedenen Konformationen fluktuieren. Durch systematische Beobachtungen von Strukturfluktuationen einer Anzahl wohlselektierter Modellproteine durch zeitlich aufgelöste Messungen des FRET Signals werden Details der Faltungsdynamik analysiert, zum Beispiel die Existenz von Faltungsintermediaten. Neben Faltungsübergängen werden Strukturfluktuationen im gefalteten Zustand untersucht. Bei diesen Arbeiten wurde die Multiparameter-Detektion verwendet: Die simultane Erfassung der Intensität, der Polarisation sowie der Fluoreszenzlebensdauer in zwei Farbkanälen ermöglicht eine optimale Charakterisierung von Konformationsfluktuationen. 3. Konformationsfluktuationen und Strukturänderungen kleiner Nukleinsäuremoleküle: Mithilfe von Einzelmolekül-FRET-Messungen haben wir die molekulare Dynamik der Konformationsumwandlungen kleiner Nukleinsäuremoleküle in Echtzeit beobachtet. Neben enzymatisch aktiven RNAs (Ribozyme) haben wir insbesondere Riboswitches untersucht. Bei ihnen bewirkt das Anbinden eines Metaboliten an die Sensordomäne eine strukturelle Reorganisation der RNA, wodurch die Proteinproduktion beeinflusst wird. 4. Entwicklung von Methoden zur Analyse von Multidomänenproteinen und deren Anwendung auf die Untersuchung von Zellpolaritätsproteinen in vitro und in vivo: Im Rahmen dieses Projektes wurden die Eigenschaften von SNAPtag und CLIPtag Domänen als FRET- Paar charakterisiert. Diese Proteine können orthogonal mit spezifischen synthetischen Farbstoffen markiert werden und werden deshalb in zellulären Anwendungen als Fusionspartner eingesetzt. Wir haben hier zunächst insbesondere SNAPtag-CLIPtag Fusionsproteine mit variierenden Linkerpeptiden im Detail untersucht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Characterization of Protein Adsorption onto FePt Nanoparticles using Dual-focus Fluorescence Correlation Spectroscopy. Beilstein J. Nanotechnol. 2 (2011) 374-383
Maffre, P., Amin, F., Parak, W. J., Nienhaus, K., & Nienhaus, G. U.
- One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small 7 (2011) 2614-2620
Shang, L., Azadfar, N., Stockmar, F., Send, W., Trouillet, V., Bruns, M., Gerthsen, D., Nienhaus, G. U.
- A Combined Single-molecule FRET and Tryptophan Fluorescence Study of RNase H Folding under Acidic Conditions. Chem. Phys. 396 (2012) 3-9
Rieger, R., & Nienhaus, G. U.
- Effect of Protein Adsorption on the Fluorescence of Ultrasmall Gold Nanoparticles. Small 8 (2012) 661-665
Shang, L., Brandholt, S., Stockmar, F., Trouillet, V., Bruns, M., & Nienhaus, G. U.
- Microwave-assisted Rapid Synthesis of Luminescent Gold Nanoclusters for Sensing Hg2+ in Living Cells Using Fluorescence Imaging. Nanoscale 4 (2012) 4155-4160
Shang, L., Yang, L., Stockmar, F., Popescu, R., Trouillet, V., Bruns, M., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.
- Intracellular Thermometry by Using Fluorescent Gold Nanoclusters. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013) 11154-11157
Shang, L., Stockmar, F., Azadfar, N., & Nienhaus, G. U.
- Polymer-coated Nanoparticles Interacting with Proteins and Cells: Focusing on the Sign of the Net Charge. ACS Nano 7 (2013) 3253-3263
Hühn, D., Kantner, K., Geidel, C., Brandholt, S., De Cock, I., Soenen, S. J., Rivera Gil, P., Montenegro Martos, J. M., Braeckmans, K., Müllen, K., Nienhaus, G. U., Klapper, M., & Parak, W. J.
- Studying the Protein Corona on Nanoparticles by FCS. Methods Enzymol. 519 (2013) 115-137
Nienhaus, G. U., Maffre, P., & Nienhaus, K.
- Temperature - The “Ignored” Factor at the NanoBio Interface. ACS Nano 7 (2013) 6555-6562
Mahmoudi, M., Abdelmonem, A. M., Behzadi, S., Clement, J. H., Dutz, S., Ejtehadi, M. R., Hartmann, R., Kantner, K., Linne, U., Maffre, P., Metzler, S., Moghadam, M. K., Pfeiffer, C., Rezaie, M., Ruiz-Lozano, P., Serpooshan, V., Shokrgozar, M. A., Nienhaus, G. U., & Parak, W. J.
- Carbohydrate-Lectin Recognition of Sequence-defined Heteromultivalent Glycooligomers. J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 2008-2016
Ponader, D., Maffre, P., Aretz, J., Pussak, D., Ninnemann, N. M., Schmidt, S., Seeberger, P. H., Rademacher, C., Nienhaus, G. U., Hartmann, L.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/ja411582t) - Complex RNA Folding Kinetics Revealed by Single Molecule FRET and Hidden Markov Models. J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 4534-4543
Keller, B. G., Kobitski, A. Y., Jäschke, A., Nienhaus, G. U., & Noe, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/ja4098719) - Impact of Protein Modification on the Protein Corona on Nanoparticles and Nanoparticle-Cell Interactions. ACS Nano 8 (2014) 503-513
Treuel, L., Brandholt, S., Maffre, P., Wiegele, S., Shang, L., & Nienhaus, G. U.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/nn405019v) - Nanoparticles Interacting with Proteins and Cells: A Systematic Study of Protein Surface Charge Effects. Adv. Mater. Interfaces 2014, 1, 1300079
Shang, L., Yang, L., Seiter, J., Heinle, M., Brenner-Weiss, G., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/admi.201300079)
