Massenspektrometer mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC-MS)
Final Report Abstract
Die Kombination von Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie wurde in der speziellen Ausführung mit einem Triple-Quadrupoldetektor zur hochempfindlichen Detektion und Quantifikation von modifizierten Ribonukleosiden konfiguriert und eingesetzt. Dabei standen drei Anwendungen im Fordergrund, nämlich die akkurate Quantifizierung bekannter Nukleoside, die Detektion von derivatisierten Nukleosiden, sowie die Identifizierung bisher unbekannter natürlicher Nukleosidmodifikationen in Nukleinsäuren. Die ersten Arbeiten zur Quantifizierung wurden unter Verwendung von synthetischen externen Standards zur Kalibrierung durchgeführt. Nachfolgend hat unser Labor die Biosynthese und Validierung von stabil isotopenmarkierten internen Standards (SILIS) aus mikrobiologischen Kulturen etabliert. Durch Fütterung von Bakterien bzw. Hefe mit 13C bzw. 15N Isoptopen wurden in den daraus isolierten Nukleinsäuren modifizierte Nukleoside als SILIS gewonnen und extern kalibriert. Die gleichen Präparationen kamen auch bei der Entdeckung zehn neuer Nukleosidmodifikationen zum Einsatz, deren Strukturen derzeit im Labor aufgeklärt werden. Die in diesen Arbeiten erwachsene Expertise wurde in zahlreichen Kooperationsprojekten zur absoluten bzw. relativen Quantifizierung von Modifikationen eingesetzt, unter anderem zur Bestimmung von Methyltransferase-abhängiger Synthese von m5C in RNA und DNA verschiedener Organismen, zur Bestimmung diverser hypermodifizierter Uridine die an Position 34 von tRNAs durch den Elongator Komplex synthetisiert werden, sowie von Pseudouridin, O-methylierten Ribosen, und m6A in diversen RNA Präparationen. Insgesamt haben diese Arbeiten neben neuen analytischen Techniken dazu beigetragen, eine Sichtweise von RNA Modifikationen zu entwickeln, in der diese dynamische regulatorische Einheiten darstellen.
Publications
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